2013年细胞分子生物学硕士实验课重点.ppt

分子生物学实验基础 基本实验 主要内容包括 核酸分离提取和定性定量 质粒和RNA提取 电泳 基因扩增和分析 PCR技术 转染和报告系统 细胞转染 荧光素酶报告 二、定量定性分析 紫外吸收法 特征 变性与复性中的紫外吸收 DNA与RNA特点 荧光染料法 通常结合电泳方法 核酸电泳定性定量 原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意，此法的特点：解决了紫外法无法判断变性和降解干扰数据的问题（样本保存）。尤其是结合核酸电泳，实际判断意义更为重要！ PCR技术 分子生物学技术 基因重组 质粒载体筛选方法 插入失活 α－互补：IPTG,X-GAL 直接筛选：抗生素 表达筛选（抗体筛选） Probe筛选 质粒载体缺点 ＣaCl2转化效率低 克隆片段小于１０kb 大量筛选时需要细胞裂解 4. DNA重组体的鉴定 外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体 （1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性图谱个体特异性，不同