第3章蛋白质的分离、纯化和表征概论.pptVIP

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 电泳原理 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 电泳迁移率(泳动度) （七）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 利用选择性吸附的纯化方法 （八）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 （一）根据化学组成测定最小分子量 （二）凝胶过滤法测定相对分子质量 （三）SDS－PAGE测定相对分子质量 沉降速度法测定相对分子量 1．羟基磷灰石层析：羟基磷灰石即结晶磷酸钙（Ca10(PO4)6(OH)2），它能吸附蛋白质，加大离子强度可将蛋白质洗脱下来。 2．疏水作用层析：疏水层析介质有苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等，蛋白质分子通过疏水作用与层析介质结合，通过能减弱疏水作用的洗脱液将不同蛋白质分别洗脱下来。 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 一、蛋白质分子的大小 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 蛋白质混合样 凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量 蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 直接测定蛋白质Mr的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法、黏度法。其中沉降速度法是经典的常用方法。 沉降系数 S 见书P40 蛋白质的沉降系数S与相对分子量Mr的关系 斯维得贝格方程 第3章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。 一、蛋白质的两性电离及等电点 一、蛋白质的两性电离及等电点 （一）胶体性质（colloidal system） 胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液 蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 Ⅱ 1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性 分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中 盐溶 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 盐析（（NH4）2SO4） 2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀 4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态 一.?分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能： 要求纯度高，不变性； 2.提取活性的酶或蛋白质： 必须保持天然活性状态； 3.