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如何解析蛋白质的空间结构？ 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 变性蛋白质的性质改变： ① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。 电泳的类型 目前电泳的类型很多， 最常见的是区带电泳，由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。 区带电泳按其支持物的物理性状不同可以分成几类： ① 滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳)； ② 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板； ③ 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋白质和多核苷酸，后者适于分离核酸，这两种凝胶电泳的分辨率都很高， 双向电泳 (two-dimensional electrophoresis) 亲和层析 蛋白质纯化方法总结： 根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法： ①分子大小； ②溶解度； ③电荷； ④吸附性质； ⑤对配体分子的生物学亲和力等。 一、蛋白质含量测定 总蛋白质含量测定有两类方法： 1、利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定。 2、利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂法(又名Lowry法)。 这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫外吸收的性质，通过分光光度法来测定。 1. 凯氏定氮法 是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白质分解出氨，测定氨的含量，除以16%，就得出蛋白质的含量。 2. 双缩脲法 蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 凡含有双缩脲相似结构的物质均能参与反应，常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。 3. Lowry法(Folin-酚法) Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。 机理：蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物（组成不清楚）。 Lowry法 目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。 此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。 4. 紫外吸收法 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 紫外吸收法的优缺点： 优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。 缺点： (1) 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差， (2) 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。 5. 考马斯亮蓝染色法 蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白质染色测定方法。 涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 6. 胶体金测定法 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与蛋白质有定量关系，是几种方法中灵敏度最高的，检测量是ng水平。 7. 某一特定蛋白质的含量测定 通常要用具有高度特异性的生物学方法。 具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们的酶活性或激素活性来测定含量。 有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适当的动物血液中时，会产生抗体。因此，利用抗体—抗原反应，也可以测定某一特定蛋白质的含量。 二、蛋白质纯度的鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法： （1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带(或峰)。 （2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动 （3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。 （4）溶解度分析： （5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的