1常规PCR实验要点.pptVIP

纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构 原因 对 策 纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA 加大模板的用量 用好的反转录酶 用温度高的反转录酶 (1)无扩增产物之模板原因 引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好 原因 对 策 合成前检查 评价、重新设计引物 换一管新引物 免费重新合成 (2)无扩增产物之引物原因 退火温度 延伸时间 循环次数 原因 对 策 递度PCR 聚合酶的延伸速度 适当增加循环数 (3)无扩增产物之PCR条件原因 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 问题2：非特异性扩增 M 1 2 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 非特异性扩增 靶序列或扩增产 物的交叉污染。 原因 开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 更换试剂、耗材。 试剂分装，贮存适当。 更换实验室和所有试剂耗材。 问题3：假阳性 　现象：空白对照出现目的扩增产物 对策 Thanks your attention！ 1989，lawyer,发现的该酶，之前使用的是Klenow片段，这个每在第一步就会因加热变性失活，后面每个循环都要加新酶。 该酶最佳的复制温度是72摄氏度。 DNA电泳上样缓冲液 电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下： （1）螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。 （2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。 （3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。 常规PCR技术和琼脂糖凝胶电泳 生物化学与分子生物学教研室 掌握： 1、PCR的基本操作方法。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。 理解： 1、PCR仪的使用方法。 了解： 1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。 2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。 教学目的： 1、PCR反应体系的建立。 2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 教学重点： 教学难点： 1、PCR反应程序的设计方法。 一、基本原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）： 体外DNA酶促扩增技术，能特异高效地在体外扩增目的DNA片段。 PCR反应的基本步骤 变性 94?C 双链DNA模板被加热变性成两条单链 退火 45~60 ?C （Tm-5?C） 寡聚核苷酸引物按碱基互补配对原则与单链模板DNA特异结合 延伸 72?C DNA聚合酶作用下，以引物为起始，合成与模板DNA互补的新链 Cycle 2 5? 5? 5? 5? 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 1 5? 5? Template DNA PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 琼脂糖凝胶电泳原理 把DNA样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。 在电泳前向凝胶或样品中预加示踪染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从而对分离的DNA进行检测。 二、操作步骤 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶(如Taq酶) dNTPs 反应缓冲液（含Mg2+） PCR反应的基本组分 10×PCR缓冲液（Mg2+?Plus）???? 5μl dNTP混合物（2.5 mM）??????????????? 4μl 上游引物（10μM）?????????????????? ???? 2μl????????????????????? 下游引物（10μM）??????????????????? ??? 2μl DNA模板????????????????????????????