高中生物奥赛辅导生化——核酸.解读.pptVIP

* 一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 * 為何 每種 DNA 的 Tm 都不一定相同？ 因為兩股間吸引力大的，其 Tm 會比較高；而兩股間的吸引力為何有大小之別？ 那是因為兩種鹼基對中，AT 之間只有兩個氫鍵，而 CG 間有三個氫鍵，因此 GC 含量越多的 DNA，Tm 就越大。 * 除了 GC 含量會影響 Tm 外，溶液中的離子濃度也有很大影響。 若溶液的離子濃度低，則 DNA 的 Tm 也會降低；因離子可中和兩股 DNA 分子上的強大負電基團 (磷酸)，若離子濃度太低，則兩股磷酸負電無法有效中和，因而造成互斥致使 Tm 下降。因此，請注意在做實驗時，不要把 DNA 溶在純水中，沒有離子的中和，兩股 DNA 可能會互斥，造成變性而沈澱。RNA 則無此問題，為什麼？ * DNA片段越大，复性越慢； DNA浓度越大，复性越快。 * 若 把各種生物的基因體取出，經變性分開兩股後，再慢慢降溫復性，則可發現各種生物復性所需要的時間不同；可以預測越複雜的基因，其復性時間越長，上圖結果的確支持此一想法。圖中的 C0t 代表測試核酸的濃度 (C0) 與復性所需時間 (t) 的乘積，通常若核酸濃度固定，則只需考慮時間，因此橫座標就直接看成時間。每一條曲線，由左上到右下方看，顯示復性的比例越來越多 (1.0 代表全部都復性成功)，而以其中點 (0.5) 作為測量的根據。 P352 图5-22，不同DNA的复性动力学曲线。 * 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） * 核酸 變性後可再黏合復性，回復原來的雙股核酸。若取兩種不同來源的核酸，經變性後混合在一起，假如兩種核酸的序列同質性高，則可能會雜合為混成的雙股核酸。 也可使用已知序列的核酸小片段，作為探針 (probe) 與 DNA 雜合；一般可先把樣本 DNA 經電泳分離後，轉印至尼龍膜上，再以放射性探針進行雜合，稱之為 Southern hybridization。 RNA 也可以在電泳後，與其互補的 DNA 序列雜合，則稱為 Northern hybridization。 例如，一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。 * Southern blotting 的轉印方法： (1) 將核酸以洋菜電泳分離開來；(2) 利用毛細作用把電泳片上的核酸色帶轉印到尼龍膜上；(3) 取下轉印膜並使核酸變性；(4) 加入放射性探針進行雜合反應；(5) 以放射性顯像觀察所雜合到的色帶。 * * 探針 雜合反應的做法實例。 菌落在培養皿長出來之後，先以濾紙複印得各菌落，利用氯仿把細菌溶並解釋出核酸，然後變性解開核酸的雙股後，再加入標有放射線的探針，進行雜合反應。 若某菌落中含有目標基因，便會與探針雜合成功，該菌落的位置便會出現放射線影像；然後再回去挑起原來培養皿上面的菌落，大量培養後可純化目標基因。 本圖可接續 24 頁的分子群殖，在培養基生長的各個菌落，可以用探針經雜合反應挑出所要的目標菌落。 * 核酸 晶片的基本原理，就是利用類似 Southern blotting 的核酸雜合反應。但是比起一般的毛細管轉印雜合，有幾點不同：(1) 以極細微的色點替代電泳色帶；(2) 一次可以處理上千萬個核酸色點，因此對同一樣本可有上千萬個測試；(3) 樣本所需的量極小；(4) 偵測方式簡便快速，也配合電腦比對分析。 因此晶片看起來很炫，也有其實質的效用。但晶片最重要的靈魂，還是在那一公分見方的小玻片，上面所點的到底是何種 DNA。也就是說，每一個點上的 DNA 是什麼，才是最重要的決定因素；若這些 DNA 能夠明確指示某種關鍵性疾病的有無，則這塊晶片便是無價之寶。這些重要的 DNA 要從哪裡來？ 當然還是要經由無數的基礎研究，獲得對生物的深刻瞭解後，所得到的基本知識點滴。 因此，晶片製作過程是一種技術 (technology)，而晶片上必須點上何種 DNA，便要靠基礎科學 (science) 來提供，兩者是不一樣的，但絕對相輔相成。 其他很多方面也有類似的情形，例如大學裡的教學與研究必須並進，不能偏廢，大家都知道。 然而，目前台灣有個很嚴重的問題，可能會影響國本。那就是在研究上，大家只重視可以馬上應用的技術，不太支持長期的基礎科學研究；在大學裡，教授又只重視如何發表大量論文 (不管有沒有用)，