第十二章 基因工程育种.pptVIP

　(1) 小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析 七、基因重组菌的培养 (一）工业使用的基因工程菌应具备的条件 1、重组的工程菌最好是分泌型菌株。 2、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 3、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。 4、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。 5、代谢控制容易进行。 6、重组菌形状稳定。 （二）重组DNA实验准则 1974年，有人提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定了有关DNA重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定采用物理密封(P1～P4)和生物学密封(BI和B2)两种方法。 1、物理密封 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。 实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。 2、生物学密封 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分BI和B2级，B2级的密封要求最严格。 进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-l标准要点是： (1) 使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置 (2) 培养装置的排气由除菌器排出 (3) 使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。 第五节 基因定位诱变 基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定位诱变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。 基因定位诱变的应用 （1）改造酶促反应的Km和Vmax进而改变酶的催化效率。 （2）改造蛋白质的最适pH值和温度稳定范围，进而改变酶的作用条件； （3）改变酶的非水溶剂中的反应性，使酶在非水条件下能起催化作用； （4）增强酶的专一性，减少不必要的副反应； （5）增强酶对胞内蛋白酶的抗性，延长半衰期，使酶的产率得到提高； （6）改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，提高产物产率； （7）提高酶的抗氧化能力和改变酶的底物专一性等。 一、定位诱变方法 （一）删除法 （二） 插入法 （三）取代法 特定的G:C变A:T法 （1）开创DNA单链区 先形成单链，再利用DNA聚合酶的降解作用。 （2）G:C变A:T 单链DNA胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后反应脱氮基变成尿嘧啶，单链区修补成双链时，A将于U配对，此时的U相应于T。 2. 错配取代 （四）低聚核苷酸诱导法 二、将变异基因送回染色体 1. 体内自发的同源重组 将诱变后的DNA分子重新导入细胞后，DNA 片段会与染色体的同源序列自发重组。缺点是重组的频率低。 2. 定位整合作用 思考题 1.??????? 微生物基因工程育种、cDNA文库 2.??????? 基因克隆载体的基本性质有哪些？ 3.??????? 简述基因工程的主要步骤。 * （1）变性：加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸：温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。 PCR的基本反应步骤及原理　 PCR反应的基本原理 （三）逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 1、mRNA的纯化： 可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。 2、互补DNA第一链的合成 mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。 3、互补DNA第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。 4、互补DNA克隆 根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。 （三）从基因所在的生物体直接取得 鸟枪法 （四）化学合成法 其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA