BioRad糖化仪的色谱原理创新教程分析.pptVIP

糖化血红蛋白分析仪色谱原理 色谱的介绍 色谱:将混合物分离成各个成分的一种分离和鉴定技术 HPLC HPLC： High Performance Liquid Chromatography ，色谱的一种 Variant /Variant II/D10 使用高效液相色谱法原理 分离的依据是离子交换，即各组分与分析柱内表面或者缓冲液的亲和力的大小不同 由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统五大部分组成。 分析柱 分析柱内填充一种填料，在填料分子的内表面偶联了带负电荷的集团 分析柱 血红蛋白分子分裂形成带正电荷的分子，可与分析柱上的 COO- 结合 分离 不同血红蛋白成分的分离基于它们与缓冲液和分析柱的亲和力的大小不同 与缓冲液的亲和力越大，越快被洗脱下来，保留时间（Retention time）越短；相反，与分析柱的亲和力越大，越慢被洗脱下来，保留时间越长。 Retention Time Retention time ：各组分未被缓冲液洗脱下来前在分析柱上保留的时间 相同组分的retention time在相同的条件下、不同的运行中应当是相同的 Retention Time 影响保留时间的因素: 1) 缓冲液 2) 分析柱 3) 温度 4) 流速 5) 样本内的其它组分 Retention Time 温度升高，保留时间缩短 -由于各组分更快的被从分析柱上洗脱下来 流速增加，保留时间缩短 缓冲液 原理上仅使用一种缓冲液和一个分析柱也能分离各个组分。 但是大部分厂家均采用多种缓冲液的方法已获得更好和更快的分离效果 缓冲液 D10/VariantII A1c方法使用 bis/tris缓冲液，其对血红蛋白的分离效果很好 这与采用磷酸盐缓冲液的Variant仪器有所不同 缓冲液 Alc 方法在每个样本的分析中通过加大B缓冲液的百分比，即增加盐浓度来洗脱分析柱上的一些成分 VariantII A1c 缓冲液梯度 A1c 缓冲液 B 缓冲液为高盐浓度缓冲液 缓冲液中盐浓度的增加可将分析柱上的Ao 血红蛋白成分洗脱下来 A1c方法 洗脱下来的血红蛋白成分包括: A1a A1b F (胎儿血红蛋白) 可变 A1c A1c P3 Ao A1c方法 A1a, A1b, A1c 和可变 A1c 成分是有糖成分结合的糖化血红蛋白 Ao, P3 和 F成分是没有糖成分结合的血红蛋白 Ao, P3 和 F成分大概占正常人红细胞内血红蛋白的90% A1c方法 A1a, A1b, A1c 为糖与血红蛋白牢固结合的成分 可变A1c：血红蛋白可失去其上结合的糖，即再变成糖化血红蛋白之前的不稳定中间产物 可变A1c需参与 A1c 的计算 可变A1c 在variant仪器，它在分析前需被溶血素移除 样本用溶血素稀释后，必须至少放置15分钟 在 variant II/D10仪器， 可变 A1c 运行中可被分析柱和缓冲液分离出来 A1c 人体内的血红蛋白的寿命平均为3个月，所以检测A1c可以评估人体内3个月之内的血糖控制情况 结果 分析柱内洗脱下来的每一个成分先后通过检测器 血红蛋白在415nm有吸收峰 检测 415nm 处的吸光度值 检测690nm 处的吸光度值作为背景吸收 结果 电脑接收检测器内的电压信号，以电压-时间为坐标轴绘出色谱图 分离出来每一个成分在色谱图上表现为一个吸收峰，计算各个吸收峰的面积与总面积的百分比 Variant II A1c Chromatogram D10 A1c Chromatogram Variant A1c Chromatogram Variant 结果计算 A1c % 通过反应因子(response factor，rf)的调整计算 variant 使用一个定值的calibrator (数值标示在瓶标签上) rf 是校正品的测量值与标示值相除得出 Variant结果计算 校正后的所有A1c结果通过rf计算 Variant每个运行均需要校正 Variant II/D10结果计算 Variant II/D10有2 个水平的calibrator, 计算斜率和截距 校正后所以A1c结果通过斜率和截距的修正 variant II/D10 的分析柱一般仅需要一次校正 谢谢！ * * Bio-Rad公司 孙玉茹 色谱仪组成 * *