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不可培养微生物对环境的作用 （石河子大学生命科学学院微生物实验室 石河子 832000） 摘要: 微生物非培养技术，如DNA指纹技术、焦磷酸测序、分子杂交技术、宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、代谢组学等的飞跃发展和广泛应用，有助于快速、准确地鉴定自然界或人工生境中微生物种群，为揭示生物修复过程中微生物群落结构、功能及修复机理提供了重要方法，提高了生物修复技术的检测效能。通时也为人类观察不可培养的微生物对环境的作用提供了技术基础，如想实时荧光定量PCR、基因指纹技术、宏基因技术、分子标记技术等。 关键词: 不可培养微生物; 宏基因组; 分子技术; 分子标记;基因指纹技术;  目录 第一章：综述 1 第一节：环境中不可培养微生物的介绍 1 一 不可培养微生物的定义 1 二 环境中微生物的多样性 1 三 不可培养的环境微生物的鉴定 2 四 不可培养微生物资源的存在形式与开发利用前景 2 第二节：制约环境微生物培养生长的因素 2 一 现有培养条件不能再现原生态环境条件 3 二 人工培养环境忽视或破坏了原生境中微生物的生态关系 3 三 人工营养基质浓度过高或氧化环境的压力 3 四 其他影响因素 3 第三节：改善微生物培养的新方法 4 一 稀释培养法(Dilution culture) 4 二 高通量培养技术(High-throughput cultivation, HTC) 4 三 模拟自然环境的培养技术 4 3.1扩散盒培养技术(Diffusion growth chamber） 4 3.2细胞微囊包埋技术(Microencapsulation): 5 四 改良微生物培养基组成和培养条件 5 五 过滤一环境适应法(Filtration-acclimatization method. FAM） 6 六 培养放线菌的新方法 6 第二章：不可培养微生物在环境应用上的技术手段 7 一 宏基因组学 7 1.1环境样品及目的基因组富集 8 1.2宏基因组DNA的提取 8 1.3宏基因组文库的构建 8 1.3.1载体的选择:载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的地位。 8 1.3.2宿主细胞的选择:不同的微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异。 8 1.4宏基因组文库筛选 9 1.4.1序列依赖性筛选法: 9 1.4.2非序列依赖性筛选法: 9 二 其他的研究方法 10 2.1分子标记技术 10 2.1.1限制性片段长度多态性分析(RFLP): 10 2.1.2简单重复序列标记(SSR)和单核普酸多态性(SNP): 11 2.1.3 3种分子标记技术的比较: 11 2.2变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE) 11 2.3宏基因组学(Metagenomics)技术 11 2.3.1 454测序是采用焦硫酸测序法: 11 2.3.2 Solexa测序: 12 2.3.3 SOLiD测序 12 三 其他的分子技术和方法 12 3.1稳定同位素标记技术(SIP)和荧光原位杂交技术(FISH) 12 3.2实时荧光定量PCR (qPCR) 13 3.3功能基因芯片 13 3.4 指纹技术 13 3.4.1基于16S rDNA 的微生物指纹技术 13 3.4.2基于功能基因的微生物指纹技术 14 3.5分子生物传感器 14 3.6 DNA 微阵列 14 第三章：参考文献 15  第一章：综述 第一节：环境中不可培养微生物的介绍 一 不可培养微生物的定义 不可培养微生物(as yetuncultured microorganisms)是指迄今所采用的微生物纯培养分离、培养方法还未获得纯培养的微生物。顾名思义,未培养微生物资源(uncultured microbial re-sources)既是蕴藏于这类微生物中的可供人类开发利用的直接的和潜在的生物资源。由于这类微生物在自然环境微生物群落中占有非常高的百分比(约为99% ),无论是其物种类群,还是新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着不同程度的新颖性和丰富的多样性,因而其中势必蕴涵着巨大的生物资源。所以,对各种自然环境微生物,尤其是对未培养微生物进行广泛深入的研究,不仅是微生物学基础理论研究的需要,也是未培养微生物资源开发利用的基础。 二 环境中微生物的多样性 人们在调查某一样品中微生物总数的时候经常碰到这样一个问题:通过显微镜观察计数出来的细胞数远远大于用各种培养基培养出来的菌落数。例如, Hayashi等报道,直接计数人肠道里的微生物,大约是1.19~4.0×1011cells /g (wetweight),但能培养出来的为6.6~12×1010CFU /g (wetweight),估计有60% ~70%的微生物是无法培养的[1]。