DNA重组克隆的单元操作.ppt

2.1 用于基因克隆的载体 2.2 DNA的体外重组 C 用于基因转移的受体菌或细胞 A DNA的体外重组（切与接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） C 转化子的筛选和鉴定（检） A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 DNApol dNTPs RNaesH 置换合成法：获得的双链cDNA 会有几对碱基缺失 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ S1 AAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAA 3’ 3’ T4-DNA ligase dCTP TdT 引物合成法：获得的双链cDNA 能保留完整 5‘ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs 3.双链cDNA的克隆 ① 平头末端直接与载体连接。 ② 平头两端分别接同聚物尾。 ③ 加装人工接头。 cDNA法分离目的基因的基本程序 1.完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。 2.特异分离程序 3.差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA。 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 多瘤病毒感染的FR3T3细胞 正常的FR3T3细胞 总mRNA 总mRNA cDNA 双链cDNA 单链cDNA 提取mRNA 合成cDNA 合成第二链 克隆 提取mRNA 产物过柱 杂交 原位杂交 病毒诱导表达的基因 cDNA克隆 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 PCR克隆目的基因的基本程序 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物。 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 5‘ 5‘ 目的基因 5‘ 变性 加热 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加热 变性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 聚合 加热 变性 引物 退火 底物 聚合 1 2 3 PCR产物末端带一个A，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。 PCR克隆目的基因的基本程序 5’ 5’ A A PCR扩增产物 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 化学合成法的基本战略 全基因合成 前提条件：基因的DNA序列已知 ① 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 3.显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）。 显色筛选法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ ori Ap + X-gal 重组子（Apr + lacZ-） 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落。 克隆DNA序列检测 1.限制性酶切图谱法 对载体上插