Ames试验步骤及报告模板.docVIP

鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验 （Ames试验） 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。鼠伤寒沙门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。 主要培养基与试剂1.培养基（1）营养肉汤培养基　取5g牛肉膏、g蛋白胨和5g氯化钠，加00mL蒸馏水并加热溶解，调pH至7.，分装后经灭菌，置普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。 成分：牛肉膏 2.5g 蛋白胨 5.0g NaCl 2.5g 加蒸馏水至 500mL 配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 （2）营养肉汤琼脂培养基　取g琼脂粉加上述营养肉汤培养基100mL，加热融化后调pH为7.4，103kPa，20min灭菌。营养肉汤琼脂培养基用作基因型鉴定的结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素和四环素试验、紫外线敏感性试验以及细菌活力鉴定等。（3） 成分：琼脂粉 15g 蒸馏水 930mL V-B培养基E 20mL 40%葡萄糖溶液 50mL 配制：首先将前两种成分高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中温孵24h，备用。 （4）顶层培养基①顶层琼脂：取g琼脂粉、5g氯化钠加蒸馏水至00mL。②0.5mol/L组氨酸-生物素溶液（诱变试验用）：取mgD-生物素（相对分子质量224）和mgL-盐酸组氨酸③顶层培养基：加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL　0.5mol/L组氨酸-生物素溶液，混匀后分装在三角瓶中，灭菌。用时融化分装于小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。 2. 试剂（1）0.8％氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）称取氨苄青霉素40mg，用0.02mol/L NaOH溶液稀释至5mL，保存于冰箱中。（2）0.1％结晶紫溶液（鉴定菌株用）称取100mg结晶紫，溶于100mL无菌水中。（3）L-组氨酸溶液和0.5mol/L D-生物素溶液（鉴定菌株用）称取g/L组氨酸和12mg D-生物素，分别溶于100mL蒸馏水中，灭菌，保存于4℃冰箱中。 （4）0.8％四环素溶液，称取40mg四环素，用0.02mol/L盐酸稀释至5mL，保存于4℃冰箱中。适用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板。（）二甲基亚砜　光谱纯，103kPa，20min灭菌。 Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 2g 加蒸馏水至 1000mL 配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 (7)40%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖 400g 加蒸馏水至 1000mL 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。（）S-9辅助因子（10％S-9混合液）① 0.4mol/L氯化镁（MgCl2）溶液：称取3.8gMgCl2，加蒸馏水稀释至100mL。② 1.65mol/L氯化钾（KCl）溶液：称取12.3gMgCl2，加蒸馏水稀释至100mL。　　　③ 0.2mol磷酸盐缓冲液（pH7.）：每0mL由4mg磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液和mg磷酸二氢钠(NaHPO4)溶