分子医学实验方法：教案分析.pptVIP

原位杂交 一种用单链RNA或DNA探针通过分子杂交对细胞或组织中的基因或mRNA分子在染色体、细胞、组织或整个生物体上进行定位的方法。可用于分析基因表达的组织特异性和基因表达水平。 探针可以是同位素标记或非同位素标记的。 In situ hybridization of TRPM8 mRNA to a prostate adenocarcinoma. 4 μm sections were hybridized with the TRPM8 probe used in Northern and dot blot experiments. A) and B) hybridization of the antisense TRPM8 probe to an adenocarcinoma of the prostate. C) sense probe of TRPM8 and D) Haematoxilin and Elaun staining of the same patient. 免疫组化技术 应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过标记抗体与组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的结合，可对蛋白进行定位、定性及定量的研究。 FACTOR IX 在巨核细胞中的表达 荧光显微技术 FACTOR IX 的荧光检测 2bF9-H FIXnull G H I J K L hFIX Bright field Overlay * 质粒转入细菌——转化 (transformation) 质粒转入真核细胞——转染 (transfection) 病毒转入细胞——感染 (infection) 转 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 筛：重组体的筛选 (插入失活法) 抗药性标记选择 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 重组DNA技术 基因的表达 优点：简单、经济、产量高 不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱、产量低 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞） 表达载体的选择 表达载体必需具备转录和翻译必需的元件：启动子、起始密码子、终止密码子等 原核表达载体：S-D序列 真核表达载体：增强子、Poly A元件 cDNA是首选对象，既可在原核细胞又可在真核细胞中表达 基因组DNA只能在真核细胞中表达 表达产物的鉴定 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 对照 样品 分子量 Marker 表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 表达产物的纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白 安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC） 如何检测一个基因的表达 mRNA的检测——northern blot RT-PCR mRNA的定量检测——实时定量PCR 蛋白质的定性与定量——western blot和ELISA 细胞内mRNA的定位检测——原位杂交 细胞内蛋白质的定位检测——免疫组化 细胞内蛋白质的定位检测——荧光显微分析 细胞内蛋白质的定量检测——流式细胞技术 核酸分子杂交 序列互补的单链DNA与DNA、DNA与RNA及RNA与RNA间可按照碱基互补配对原则形成杂交分子 如果将杂交分子中的一条单链连上标记物就成了核酸探针 标记可以是同位素标记或非同位素标记 MRNA的检测——RNA印迹（NORTHERN BLOT） 用DNA探针来检测特异基因的mRNA，以分析该基因的表达情况及mRNA分子的大小，特别用于分析细胞生长、分化、发育过程中有关基因的表达。 /v_show/id_XMTQ1NDg1NDcy.html RT-PCR MRNA的定量检测——实时定量RT-PCR（REAL TIME RT-PCR） Real time PCR是一种定量PCR技术，用于定量测定特定基因的起始模板数。 当模板为来自mRNA反转录的产物cDNA时，可用于定量测定mRNA的模板数，从而确定特定基因的表达水平 蛋白质的检测——WESTERN BLOT 这是一种利用特异抗体来鉴定相应蛋白质的技术 蛋白质首先