基因工程复习材料01.docVIP

基因工程 第一章 绪论 1、基因工程也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。 2、基因工程优点 打破了物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移 3、理论依据 1）不同基因具有相同的物质基础 2）基因是可切割的 3）基因是可转移的 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 4、基因工程研究的基本操作程序 a、目的基因的分离和制取 b 、表达载体的构建和目的基因与载体的拼接 c、 基因转移（导入） d、 转基因植株的再生与检测 e 、后代的遗传分析 第二章 基因工程工具酶 限制性内切酶 1、限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 2、修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。 3、限制性核酸内切酶的概念 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶 限制修饰：单功能 蛋白结构：同源三聚体 辅助因子：Mg2+ 识别序列：4-6bp回文序列 切割位点：识别序列内或附近特异切割 5、Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。 6、Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ②建立DNA分子的限制酶图谱。 ③构建基因文库。 ④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。 ⑤改建质粒。 7、Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。 星活性产生的原因如下： ①反应体系中甘油的浓度大于5%。 ②酶用量过大，大于100U/微克DNA。 ③低离子强度，小于25mmol/L。 ④高pH，大于8.0。 ⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 ⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价 离子的存在。 8、影响限制性核酸内切酶活性的因素 ①DNA样品的纯度 ②DNA样品的甲基化程度 ③ 酶切反应的温度 ④DNA分子结构 ⑤核酸内切酶的缓冲液 9、同裂酶与同尾酶 同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。SmaI和XmaI(CCCGGG)。 同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。 10、Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。 11、Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的3′粘性凹出末端 抹平DNA的3′粘性凸出末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列 12、T4 DNA连接酶的作用机制 DNA连接酶是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，已发现的DNA连接酶主要有两种：T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 T4 DNA连接酶的作用机制： ①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 ②E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。 ③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′－磷酸二酯键