国家重大科技专项-公斤级重组蛋白分离纯化复性技术平台研究精要.docVIP

申请编号： 国家重大科技专项 “创新药物和中药现代化” 课题申请书 课题名称: 公斤级重组蛋白分离、纯化、复性技术平台研究 所属专题： 生物技术药物规模化制备技术平台 专项主题： 新药研究与开发的平台技术研究 申 请 人： 罗 永 章 联系电话： （010传真： （010 申请单位： 清华大学生物科学与技术系 通讯地址： 清华大学生物科学与技术系 邮 编： 100084 中华人民共和国科技部 二OO二年六月 课题内容提要 基因工程最常用的表达体系是大肠杆菌，该表达体系不但可以提高重组蛋白的表达率、降低蛋白酶对目的蛋白的水解、简化纯化工艺及提高重组蛋白的纯度，而且还可降低生产成本及改进产品质量。然而大肠杆菌表达蛋白一个主要技术障碍是蛋白质的二硫键错配问题及相关的复性问题。考虑到蛋白质药物在中试规模及工业化时面临的纯化问题、折叠复性问题、质控问题及节约成本等问题，我们依据自身理论和实验基础，提出1）建立独特的纯化大肠杆菌表达的蛋白质的生产工艺；2）搭建不同类型的蛋白质复性技术平台； 4）大幅度降低成本。我们选定的主要研究模型是抗癌基因工程药物YH-16，希望通过上述研究使YH-16生产能力达到每个制备周期0.5公斤的水平。 课题的意义和必要性 许多临床用药量大的重组蛋白药物如BMP、TPA等，由于其每支几毫克至几十毫克的用量需要建立每年公斤级的生产能力才能满足临床及市场需求。如何建立与市场需求相匹配的生产规模及相应的工艺路线，已成为这些药物走向市场的重要问题。目前，抗肿瘤药物研究领域血管抑制剂蛋白药物研究开发成为世界范围内的“热点”。 血管抑制剂蛋白药物如rh-Endostatin、rh-Angiostatin等一个主要特征为用量大（几十毫克～几百毫克/天、人），且连续多日给药，使得生产规模必须达到每天几百克至几千克。如美国EntreMed公司由于采用酵母生产体系生产rh-Endostatin及rh-Angiostatin，一方面产品质量无法保障，另一方面生产量的限制影响了临床试验的进展，高昂的生产技术成本也使得EntreMed没有财力扩大生产规模。 基因工程宿主体分为真核和原核细胞两类，采用真核宿主的优点是可以糖基化，且在蛋白表达率低的情况下一般不需要经过复性过程（在高表达率时需要复性）。但是，产量低、生产周期长、生产成本高、生产过程不易控制等缺点严重影响真核载体的应用。尽管采用原核载体（如大肠杆菌）有着产量高、周期短、成本低、生产过程可控等优点，但目的蛋白易形成包含体。如何将包含体纯化及有效的复性到有活性的天然状态则是制约原核载体的大规模应用的关键环节。 随着人类基因组草图的完成，人类功能基因组学研究在世界范围内迅速开展。目前已有许多基因功能被阐明，将这些功能明确的基因开发成为重组蛋白类药物用于人类健康，已成为各国政府、大学、研究所及各种私人公司竞相追逐的目标，众多大企业投入巨资开展此项研究。一方面随着研究的深入，将了解越来越多的基因功能，另一方面这些功能已知的基因所编码的重组蛋白将逐渐成为走向市场的药物。然而在这些重组蛋白市场化过程中，一个突出的“瓶颈”障碍是大用量重组蛋白的生产技术，尤其是大肠杆菌生产的重组蛋白包含体复性、纯化技术的落后，造成大量蛋白药物无法形成生产规模，或是生产周期长、成本高昂。世界范围内“上游”基因功能研究“火热”，而“下游”生产工艺研究滞后的矛盾越来越突出，每年仅在美国因蛋白质复性技术障碍造成的损失达几十亿美元。 综上所述，克服大肠杆菌表达蛋白的复性技术障碍，系统地建立有通用性的纯化工艺及复性技术平台成为全球范围内重组蛋白研究的一个重大且急迫的技术问题。此外，在重组蛋白药物产业化方面，尤其是对用药量大的蛋白，有效的产品质量控制至关重要。基于以上诸多问题，有必要依据国内现有科研基础开展《公斤级重组蛋白产品分离、纯化、复性技术平台研究》，使原有的科研基础转化为世界领先的科研成果，将我国基因工程“下游”技术的整体水平提高一个层次。 课题主要研究内容的国内外技术现状和发展趋势，以及与课题有关的技术领域的国内外专利申请和授权情况 重组蛋白的生产过程包括“上游”的基因克隆、蛋白表达，及“下游”的高密度发酵、蛋白纯化、复性、和制剂等过程。目前世界范围内基因工程的上游技术已逐渐成熟，而下游生产技术尤其是大规模