2012第二章核酸的分离纯化要点.pptVIP

硅胶吸附DNA 聚亚乙基亚胺（简称PEI，或Polymin P）是亚乙基亚胺（Ethyleneimine）的线性聚合物，分子式中的n约为700 – 2000。其胺基的pKa在11-12之间，在一般中性的溶液中带有大量的正电荷，为阳离子多聚物。 利用聚亚乙基亚胺沉降核酸或蛋白质的原理和使用盐析法有很大的不同，效果也不一样。比如用NH2SO4，是去除蛋白质的水分子层（水化膜），需要，如50%的NH2SO4饱和度。而聚亚乙基亚胺只需要0.2%（w/v）的浓度，直接和酸性蛋白质结合形成絮凝物。因此，聚亚乙基亚胺是在沉淀物中。 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、 变性：RNA电泳前加热变性、电 泳时加变性剂保持RNA处于变性 状态，DNA电泳前和电泳中不变 性. 2、 转膜：RNA转膜前不需变性和中 和处理, Southern印迹时，DNA转 膜前需进行碱变性及中和处理. 3、 靶核酸为RNA. 三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检 测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸 分子量 四、 原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交； 根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交. 2、杂交过程： (1) 组织或细胞的固定 理想固定液应具备： ? 保持组织细胞的形态 ? 对核酸无抽提，修饰与降解作用 ? 不改变核酸在组织细胞内的定位 ? 不阻碍核酸与探针的杂交过程 ? 对杂交信号无遮蔽作用 ? 理化性质稳定 什么最好？ 多聚甲醛 (2) 组织细胞杂交前的预处理 ? 去垢剂(如Triton x-100和SDS)和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质 ? 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成的核酸蛋白复合体 ? 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落 (3) 探针的选择与标记 ? 以获得最好杂交效果为依据选择探针 ? 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb ? 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定，检测结果分辨率高，但信号检测时间长 ? 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察 (4) 杂交 ? 杂交液体积小：10~20μl ? cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ ? 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h, RNA探针杂交过夜 ? 杂交前一般将组织切片置95 ℃5~15分钟使DNA变性 ? 冲洗温度一般不超过50 ℃ (5) 杂交结果检测 ? 所用探针为核素标记,放射自显影检测 ? 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测 五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。 (一) RNA酶保护分析法 1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。 RNA作为探针杂交的情况。 2、杂交过程 ? 制备待测RNA?RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标记RNA探针 ? 杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交 ? RNaseA和RNaseTI除去单链RNA ? 电泳分离RNA ? 放射自显性检测杂交结果 (二) 核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法. 用于DNA作为探针的情况。 2、杂交过程 ? 制备待测RNA：总RNA或mRNA均可 ? 单链DNA探针的制备与标记 ? 杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交 ? 核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA ? 电泳分离DNA/RNA杂交体分子 ? 放射自显影检测杂交结果 第三节探针的标记 一、探针的种类 ? 基因组DNA探针 ? cDNA探针 ? RNA探针 ? 寡核苷酸探针 二、 标记物 (一)理想标记物应具备的特性： ? 高度灵敏性 ? 不影响碱基配对的特异性 ? 不影响探针分子的主要理化性质 ? 对酶促反应活性无影响或影响不大 ? 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性 三、标记方法 体内标记法： 将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中 体外标记法： 化学标记法：标记物分子上的活性基因与探针分子上的某些基因