PRO542体外阻断CD4细胞HIV感染的研究.docVIP

免疫学实验设计 题目 PRO-542体外阻断CD4细胞 HIV感染的研究 班级 08级临床医学本科一班 姓名 丁佩毅 5108001028 魏 巍 5108001041 吴 涛 5108001044 杨依航 5108001046 田宜平 5108026014 1 研究背景 AIDS是因HIV侵入机体，引起细胞免疫严重缺陷，导致以机会性感染、恶性肿瘤和神经系统病变为特征的临床综合症。 自1981年发现首例艾滋病例以来，AIDS在全球广泛蔓延。根据联合国艾滋病规划与世界卫生组织联合发布的报告，2009年全球共有3330万艾滋病感染者；我国自1985年发现第一例艾滋病以来，截至2009年底，现有艾滋病病毒感染者和病人约74万。 HIV属转录病毒，根据血清反应和病毒核酸序列可分为两型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型广泛分布于世界各地，是引起全球艾滋病（HIDS）流行的主要病原。 临床上目前常用的抗HIV药物主要有以下两类：（1）核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂：此类药物的作用机制是干扰HIV的DNA合成。（2）蛋白酶抑制剂：其作用机制是抑制HIV蛋白酶水解，使病毒的大分子聚合蛋白不被裂解而影响病毒成熟与装配[1]。 近年来,以封闭gp120和CD4的结合位点, 阻断CD4受体与gp120的接触为靶点, 研制出一系列新型 HIV-1抑制剂，主要有CD4的类似物、可溶性的CD4、毒素与CD4的共扼物、CD4或gp120的特异的单克隆抗体和一些化学小分子。gp120与CD4 结合抑制剂还包括右旋糖苷硫酸盐，resobene ,IgG2-CD4融合蛋白异四聚体PRO-542以及FP21399(一种双偶氮染料)等。 PRO-542是一种由CD4的D1~D2区和HIV 一种天然抗体IgG2 的保守区 融合而成的重组蛋白，其含有4个IgG2 分子,轻链的可变区被CD4分子的D1/ D2 取代。PRO-542含有4个gp120 的结合位点，因此，比可溶性的CD4 蛋白有更好的抗HIV活性和机体耐受性,目前正处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段[2-3]。 2 研究目的 探究病毒吸附抑制剂PRO-542对细胞感染HIV的拮抗作用。 3 实验原理 HIV主要侵犯宿主的CD4+ T细胞以及CD4分子的单核/巨噬细胞、树突状细胞和神经胶质细胞等。HIV通过其囊膜的gp120与靶细胞膜表面CD4分子结合，导致gp120构想改变，暴露出被其掩盖的gp41，gp120-CD40结合CCR5,gp41的N末端嵌入细胞膜，病毒包膜与细胞膜发生融合，病毒核心进入靶细胞。病毒吸附抑制剂PRO-542可以通过结合HIV-1表面的gp120，使gp120失活，干扰毒粒吸附到靶细胞，阻断HIV-1侵入免疫细胞。本次实验利用Ficoll离心法分离提取HIV-1志愿者的PBMC，并从艾滋病患者血清中离心分离出HIV-1病毒，将病毒和不同稀释度的抗体结合并设置对照组进行培养，通过p24ELISA检测上清病毒载量，反应病毒的感染情况。 4 实验材料 PR0-542、HIV-1志愿者全血、RPMI-1640培养基(100U青霉素，100μg链霉素，5μg/ml IL—2和10%热灭活胎牛血清)、HIV-1病毒培养液、培养箱、液氮、细胞培养板、HIV-1p24抗原检测试剂 5 实验方法 5.1 HIV-1-志愿者PBMC的分离 人外周单个核细胞分离自HIV-1-志愿者，采取全血后用Ficoll离心法分离PBMC，培养基为RPMI—1640。所有细胞培养在37℃、5%二氧化碳培养箱。 5.2 培养和分离HIV-1病毒 无菌从3名艾滋病患者抽取5ml全血，分离血清后混合，在p2实验室中，上述制备PBMC暴露于纯粹病毒2h后，添加培养液使细胞浓度为5×104 个/毫升。每2天换1次培养液，7天后，收集上清1000g离心去除细胞。检测TCID50后将含病毒上清分装于液氮保存。 5.3 病毒中和实验 病毒中和实验使用上述制备PBMC。方法如下：先把500TCID50（50%的病毒组织感染量）病毒和不同稀释度（1:1、1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024、1:4096）的抗体等量混合后37℃预孵育60min，加入到含5×104 cells/well的培养板中，同时做未加抗体组做为对照，每组做3孔。37℃孵育过夜，洗去未结合的病毒和抗体，37℃ 5%二氧化碳培养箱培养，每2天换液1次，去除上清，加入新鲜培养基。10d后收集培养上清，使用p24ELISA检测培养上清病毒载量。重复做3次独立的实验。含病毒操作均在p3实验室进行。 5.4 p24ELISA检测培养上清病毒载量 培养上清HIV病毒RNA载量使用p24ELISA进行检测。抑制率%=