第4章GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选解决方案.docVIP

第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选 用 B-Domain 蛋白作为亲和材料纯化抗体时，由于其与 IgG 结合能力较强，在用于抗体纯化的洗脱过程中，洗脱条件苛刻，需要 pH2.4 的洗脱缓冲液，这种极端条件会很大程度地破坏抗体的活性，从而影响所纯化抗体的使用价值。而 B-Domain 用于抗体的定向固定时，则是其抗体结合力越强，越有利于定抗体的定向固定。噬菌体展示技术作为一种分子体外进化技术，经常应用于蛋白质或多肽的改造。鉴于此，本文构建了 GB2 的随机突变文库，首先是采用易错 PCR 将 GB2 进行随机突变，将突变 PCR 产物克隆至噬菌粒 pHEN I 中，然后用电转化的方式，将连接产物转化至 E.coli TG1 中，构建了 mtGB2 的随机突变文库，用 M13K07 辅助噬菌体感染 TG1 文库，得到 mtGB2 的噬菌体展示文库。以 IgG 为淘选靶分子，对文库进行两个方向的淘选，一个是淘选在 pH4.0 的洗脱缓冲液中能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体纯化领域；一个是在 pH2.4 仍不能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体的定向固定。 4.1 材料、仪器与试剂 4.1.1材料 E.coli TG1 购自Invitorgen、噬菌粒 pHEN I、Help phage M13K07 由英国剑桥医学研究委员会 (MRC) 分子生物学实验室 Greg Winter 博士惠赠；小鼠腹水由本实验室制备。 4.1.2主要仪器 —BIO-RAD 凝胶成像系统—低温离心机（2K15）Sigma 公司 —PCR 扩增仪（Gene Amp PCR system 2400型）PE 公司 —型稳压电泳仪（DYY-I）北京六一仪器厂 —超低温冰箱（CD-196/HC）Thermo 公司 —电转仪 Bio-Rad 公司 —电击杯 Bio-Rad 公司 —超纯水制备仪（67120） 美国 Millipore公司 —恒温摇床上海智诚 —96 孔酶标板 美国 Costar 公司—37℃ 恒温孵育箱 日本SANYO —型全自动灭菌锅（MLS-3750） 日本 SANYO 公司 —酶联免疫检测仪（MK2） Labsystems 公司 Taq DNA 聚合酶脱氧核糖核苷酸（dNTPs）限制性内切酶（）DL2000 DNA marker、λ-HindⅢ DNA marker，DNA 片段纯化试剂盒、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、质粒提取试剂盒均购买与TaKaRa 公司；T4 DNA ligase 购自NEB公司；Goldview 核酸染料购自博大泰克生物基因技术有限责任公司；Yeast extractTryptone 购自 Oxoid 公司称取 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至 1000 mL。称取 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，再加入 Tween-20 0.5 mL。CAGGAAACAGCTATGACC pHEN-R：GCCCCATTCAGATCCTCTTC 2） 以 pGEX-GB2 为模板，pHEN-GB2-Nco I、pHEN-GB2-Xho I为引物进行PCR，扩增 GB2 片段。 3）分别 NcoI/XhoI 双酶切 pHEN I 噬菌粒与 PCR 产物，分别割胶回收纯化。 4）用 T4 连接酶将 GB2 克隆至 pHEN I 噬菌粒中，转化 E.coli DH5a 细胞。 5）菌落 PCR、NcoI/XhoI 双酶切验证所得克隆子，选取阳性克隆子送测序。 4.2.2 GB2 的随机突变 1）易错 PCR 对 mtGB2 进行随机突变，进行 4 组, 每组的体系不同，分别降低一种 dXTP 的浓度至 10%，引物为 pHEN-F、pHEN-R，每管 100 μL体系，如下表： 表4-1 易错 PCR 体系 Table 4-1 The reaction system of error PCR ? 1 2 3 4 其他条件 ﹡ ﹡ ﹡ ﹡ dATP 0.02mmol/L 0.2mmol/L 0.2mmol/L 0.2mmol/L