第一节第二节核酸的凝胶电泳要点分析.ppt

基因工程原理 第二讲 基因操作的主要技术原理 袁子国 Sep 23，2011 前 言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳 前 言 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段； 优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收。 核酸凝胶电泳的基本原理 1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小（构型）、介质粘度等的函数； 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。 一、 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis （一）凝胶的制备及电泳 制胶 1.准备好凝胶成型器，插入成型梳。 2.将1.5g琼脂糖加至100 ml 1×TAE缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，冷却至60℃以下。 3.加入5ul溴化乙锭（终浓度0.5ug/ ml ）至熔化的琼脂糖液中混匀，但避免出现气泡。 4.将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶。 电泳 1.待胶变硬，直到它呈乳白状且不透明（约20分钟），小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 2.用移液器吸取2μl 的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5μl样品，混匀后，小心加入点样孔。 3.接通电源，调节电压至4-5V/cm，DNA从负极移到正极。电泳时间30－60分钟。 4. 电泳结束，关掉电源。 （二）DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 不同类型琼脂糖的性质 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 （二） 凝胶载样缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 （三）琼脂糖凝胶中DNA的检测 1 凝胶的EB染色 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光是通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 尽管在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。 使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 EB替代品 sybr-green 不稳定，易降解 goldview 宣称无毒,不灵敏,回收连接不好,对大片段的DNA染色还可以，荧光易猝灭 gelred 低毒,效果很强!但价格昂贵 genefinder 效果一般，以前怀疑它是sybr green genegreen 不稳定，易降解 gelRed gelGreen的凝胶染色 它们是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 （四） 凝胶中DNA的成像 （五） 凝胶中DNA的回收 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE 在TEMED (四甲基乙二胺)催化过硫酸铵还原产生的自由基