专题二流式细胞仪要点分析.pptVIP

BD是世界上最大的研发、生产和销售医疗设备，医疗系统和试剂的医疗技术公司之一； 公司的业务可分为BD医疗、BD诊断和BD生物科学三大类； 1897 BD在纽约创立。 1898 BD就开始生产玻璃、金属注射器和体温计。 1961 BD发明了世界上第一支一次性塑料注射器和一次性医用针头，进入一次性医用产品阶段； 1973 BD推出全球第一台商业化流式细胞仪，确立了在细胞学研究领域的领先地位。 1975 BD生产了世界上第一台BACTEC110血培养仪。 1986 BD推出细胞分析史上第一个双色荧光直接标记的试剂。 1995 BD生产出当今世界唯一的全自动四色流式细胞分析分选仪。 2008 BD推出升级型流式细胞分选仪BD FACSAria II。 1973年世界第一台商品化的流式细胞仪FACS I由BD公司和美国斯坦福大学共同研制成功； 1980年北京师范大学引进了中国的第一台流式细胞仪FACS II 。 BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有率为75%，在中国75% 。 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等； 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量（如大小，内部结构，DNA，RNA，蛋白质，抗原等)； 检测直线流动状态中的单个细胞或颗粒；由液流包裹，再外力作用下。 流式细胞术的特点 检测速度快，分析样本量大： 在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟成千上万个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 ； 可同时分析单个细胞的多种特征： 使用不同荧光素标记的单克隆抗体或荧光染料对细胞进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确； 强大的分选功能： 在分析的同时可以对特定群体加以分选。 保持细胞完整性 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 流式检测的样本 可检测的样本种类多样： 各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等 New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 样本制备： 单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） 5×105～1×107cells/ml，约0.5～1ml，300目筛网过滤 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 …… 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 …… 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 激光光源：气冷式氩离子激光器（488,633） 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光） 主要由计算机及其软件组成 散射光信号 散射光信号 测得的FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理。 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器 荧光素的激发和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm） 激发光谱（Excitation，Ex）： 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。