王刚实验六真核生物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳要点分析.pptVIP

二、实 验 内 容 （一）植物基因组DNA的快速提取 CTAB法的原理 CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离; 能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（＞0.7 mol/L NaCl）可溶，通过乙醇或异丙醇可沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 ? 快速冷冻植物组织和轻轻操作DNA溶液（可减少DNA分解和因机械损伤而断裂）。 ? 研磨要快而彻底。 ? 振荡要轻，不使用太细的吸头，不能吸得太快（减少DNA机械损伤）。 ? 多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA 抽提中的主要污染物，要尽量使用幼嫩叶片。 ? 所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染。 ? 乙醇一定要吹干。 ●上样缓冲液： 组成：溴酚兰（在碱性液体中呈紫兰色，作指示剂） 蔗糖 甘油 ●核酸染色剂：溴化乙锭（EB） 一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA含量成正比。 1. 凝胶制备 ： 用1× TAE制备0.8%琼脂糖凝胶。称适量琼脂糖加入TAE ，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时，加入 EB 至终浓度 0.5μg/mL，倒入胶板(4-6mm) ，待胶凝固后拔出梳子。 ? 倒胶时不要高于60℃ ，温度太高会使制板变形，但也不能低于45 ℃ 。 ? 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。 ? 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多。 ? EB有毒，切勿用手接触，更不要乱扔，以免污染环境。 ? 紫外线照射不要太久。 * * 实验六 植物基因组DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳检测 1、掌握高等植物基因组DNA提取的方法和步骤。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 一、实 验 目 的 （二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取DNA的一般原理:破裂细胞→含去污剂的溶液消化分解核蛋白质，然后使蛋白质和多糖等杂质沉淀， DNA进入水相 →酚、氯仿抽提→经异丙醇沉淀等方法得到DNA，并进一步洗涤纯化。 （一）植物基因组DNA提取（CTAB法） ? 实验原理 ? 仪器：高速离心机、水浴锅、陶瓷研钵、移液器、 1.5ml离心管。　 ? 实验材料 高等植物幼嫩叶片 ? 实验仪器和试剂 ? 试剂：CTAB提取液 、氯仿- 异戊醇(24：1)、 异丙醇 、70％乙醇 、ddH2O 、液氮 　CTAB提取缓冲液的配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中. CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； PVP40（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，有效去除多酚， β-巯基乙醇是抗氧化剂，能有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 5%(W/V) PVP40 20 mM 　EDTA （pH8.0） 2%（V/V）使用前加入 3%(W/V) 1.4M 100 mM 终浓度 β-巯基乙醇 CTAB NaCl Tris-HCl （pH8.0） 组份 准备：CTAB溶液于 65℃水浴预热。 研磨：植物组织于液氮中磨成粉状后，取0.1g 倒入1.5ml离心管中。 裂解：迅速加入预热至65℃的CTAB溶液400μl于离心管中，混匀，于65℃水浴中反应60min (时 间长, DNA产量高), 不时摇动。 ? 实验方法步骤 （破碎细胞） 4. 抽提： 冷至室温后，加入等体积氯仿- 异戊醇(24：1) 溶液， 轻柔颠倒混匀几次，使有机相由无色变为深绿色，静置10 min 。 5. 离心：室温下10000rpm离心5 min 。仔细移取上清液至另一离心管（若上清仍为绿色，应重复抽提步骤） 6. 沉淀：加入2/3体积异丙醇，小心混匀，-20℃下放置30min沉淀DNA。　 （抽提去蛋白） （沉淀核酸） 7. 离心：10000rpm离心5 min ， 去异丙醇上清液。8. 洗涤：沉淀用70%乙醇漂洗两次，10000rpm离心5min ，吹干。　　 9. 溶解：将DNA溶解于30μl ddH2O中, -20℃贮存备用。 　　　 ? 注意事项 蛋白质: 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA: 常选用RNase消化。 酚类物质: 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖: 提取液中加1％PVP。 D