细胞衰老细胞凋亡研究分析综述.docVIP

细胞的衰老与细胞凋亡研究的综述 2009级 生物科学 平昊 摘要： 在细胞成熟与行使功能后，即走向衰老，细胞总体的衰老导致个体的老化细胞衰老有诸多因素调控当前多集中于分子水平上的研究，如探索衰老相关基因，癌基因抑或抑癌基因等癌肿相关基因与细胞衰老的关系，染色体端粒与衰老的关系，以及一些与疾病有关的无知在衰老中的作用。 细胞终末分化与衰老最终导致细胞死亡，细胞死亡有两种类型：细胞程序性死亡和细胞坏死。前者又称细胞凋亡，多年来的研究表明细胞凋亡与个体生长、发育以及疾病发生与防治有着密切的关系，所以找出细胞凋亡的关键调控基因及其作用机制将是研究细胞死亡的重点工作。 关键词： 衰老 凋亡 研究方法 检测方法 细胞凋亡的主要检测方法研究进展 1.1 简介 细胞凋亡是由基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡的特征是具有明显的形态学改变,包括细胞膜发泡,细胞皱缩,线粒体膜电位下降,染色体凝聚和DNA片段化等。近年研究表明,细胞凋亡在疾病的发生、发展中起着非常重要的作用。研究表明,机体内细胞凋亡是受多基因精细调控的结果,过量或者过少的细胞凋亡均对机体有害。人类及动物的多种疾病的发生发展均与细胞凋亡密切相关,如果能恰当的阻断或加速细胞凋亡,可以为治疗或防控凋亡相关疾病提供新的治疗途径。细胞凋亡的检测是开展凋亡研究的必需步骤,凋亡的所有检测方法是基于凋亡细胞所特有的形态学和生物化学特征建立的。 1.2主要检测方法 1.2.1 细胞凋亡的形态学检测 细胞发生凋亡时具有固有的形态特征,如细胞核表现缩小、染色质边缘化、凝集,凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起,且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。DNA特异性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以与DNA的A-T碱基区进行非嵌入式结合,从而使细胞核着色,在紫外光激发时会出现明显的荧光。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可以观察细胞染色质的形态学变化、膜结构及通透性的改变,从而鉴别凋亡细胞、正常细胞及坏死细胞。细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。 1.2.2 细胞凋亡的DNA片段化检测 DNA ladder 提取凋亡细胞的基因组DNA,经电泳后染色观察可见180 bp~200 bp及其不同倍数的弥散状DNA条带,即DNA ladder。DNA ladder被视为经典的检测细胞凋亡的指标,但DNA凝胶泳特异性虽高而灵敏度偏低,不适于检测细胞凋亡初期DNA链的轻微损伤。 TUNEL检测法 TUNEL法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活,染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180 bp~200 bp的含3′-OH末端的片断,脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸(dUTP)标记到缺口3′-OH的末端,依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB,凋亡细胞显色明显,而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂,故不被显色。 1.2.3 ELISA检测法 应用ELISA方法也可以检测DNA片段化,在凋亡的早期DNA发生断裂,核小体释放进入细胞质中,核小体是染色质的基本单元,通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。此方法既可定性又可以定量,而且适合检测大批量样本,不需要特殊的仪器。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内,进而导致结果偏高,因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件。 1.2.4 细胞凋亡的线粒体膜电位的检测 细胞发生凋亡过程中,线粒体也会发生变化。线粒体通透性转换孔的开放导致的线粒体膜通透性发生变化,此被认为是线粒体导致细胞死亡的众多途径中关键的一个。研究证实细胞在凋亡刺激信号的刺激下线粒体膜电位发生下降,线粒体膜电位的降低是细胞凋亡的早期事件,而且细胞聚集染料能力的下降可以用来反映膜电位的下降程度,进而通过流式细胞术检测线粒体内跨膜电位的变化。 1.2.5 细胞凋亡相关的基因检测 凋亡促进基因表达的检测 caspases家族基因表达产物是促进细胞发生凋亡的主要酶类,细胞凋亡机制的执行基本都是由一个进化上保守的caspase完成的。在凋亡中根据其作用及扮演的角色不同,caspase可以分为2类,启动caspase和执行caspase。执行caspase是被启动caspase激活后,执行caspase经过一系列的酶激活级联反应,导致最后细胞凋亡。不同的细胞系与不同的凋亡刺激因素 会引起不同种类的caspases活化。因此,不同的细胞凋亡,也需要选取不同的caspase来检测,最终确定凋亡促