RNAi技术其实验操作.docVIP

.页眉. .页脚. RNAi技术及其实验操作 点击次数：252 发布时间：2010-11-14 14:04:09 RNAi技术及其实验操作 目前对RNAi （RNA interference）的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 　　如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA 和反义RNA） ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA（dsRNA ） 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默（post - transcriptional gene silence , PTGS）。 　　各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。也就是说，RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法：①化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3`端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。② siRNA表达载体：在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。③dsRNA表达载体：多用于果蝇、线虫等低等生物，在体内表达后被Dicer切割成21-23nt的siRNA；或在体外利用Dicer、RNaseIII切割dsRNA产生siRNA，纯化后使用。　　最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3＇末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。　　这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。　　有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6或者RNaseP的组分H1 RNA转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。　　另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而