博士研究生课高级生物化学与分子生物学专题分子生物学技术在病理学上的应用许丽艳课件解析.ppt

* Application of Molecular Biology Technique in the Pathology DNA Analysis Southern Blot: telomere length; amplification; deletion PCR: mutation; virus In situ hybridization: gene location; translocation DNA Chip: SNP Bioinformatics RNA Analysis Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes In situ hybridization: gene location cDNA microarray : differentially expressed genes Bioinformatics Protein Analysis Western Blot: protein concentration Immunohistochemical Technique: protein location 2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteins Bioinformatics 双向电泳技术及其应用 双向电泳技术的原理 利用蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分 双向电泳技术的发展历史 1975年O， Farrell首先提出了经典的双向电泳技术体系。他用管状载体两性电解质凝胶作为第一向进行等电聚焦，聚焦后的管状凝胶在含SDS的缓冲液中平衡后，以琼脂糖包埋置于垂直板SDS凝胶的浓缩胶上，然后用Laemmli的不连续SDS梯度凝胶电泳作为第二向。这种双向电泳技术被称之为ISO-DALT系统。ISO-DALT系统存在着许多问题，如易发生阴极漂移，载体两性电解质pH梯度不稳定以及重复性差等。 1985年G?rg A等发展了IPG-DALT系统双向电泳技术。它利用固相pH介质来形成一定范围的pH梯度。固相pH介质是一类丙烯酰胺的化合物，它与聚丙烯酰胺共价结合后形成一定范围的pH梯度。它不受脱水、重新水化和电场等因素的影响，因而具有不产生阴极漂移，pH梯度稳定，上样量大，重复性好，分辨率高等优点。目前世界上越来越多的实验室选择IPG-DALT系统双向电泳技术。 样品的预处理 样品的预处理是双向电泳的重要环节之一。双向电泳样品预处理的目的之一就是使样品在样品缓冲液中充分溶解、变性和还原，完全打破蛋白之间的相互作用。通常的样品缓冲液包括8M尿素，4%(w/v)CHAPS，50-100mM DTT和40mM Tris。然而这种“标准”的样品缓冲液并非对所有蛋白质的预处理都是理想的，特别是膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及具有高抗性组织的蛋白(如头发和皮肤等)。 最近有许多可改变这些蛋白质溶解度的报道。如Rabilloud等介绍了用硫脲(2M)和尿素(5-7M)来增加蛋白的溶解。Herbert等用不带电荷的三丁基膦 (tributyl phosphine，TBP)代替含巯基的还原剂DTT，它既可增加蛋白的溶解，同时又不会因DTT在碱性环境带电而造成蛋白的丢失，特别是对于那些易于以二硫键相互作用的蛋白质(如角蛋白)。另外，样品的预处理还应考虑去除非蛋白质组分(如核酸、盐离子)。在细胞蛋白质变性之前应通过透析（或层析）和微量的 DNase/RNase来去除盐离子和核酸，以减少条纹和不均一背景的出现。 胶条的选择和第一向等电聚焦 目前商品化的IPG胶条已逐渐为各实验室所采用。胶条的选择直接影响到实验结果的好坏。通常选胶的原则主要有以下几点：1.快速筛选或仅对最高丰度蛋白质感兴趣时可选择短胶条，而要获得最高分辨率和最大上样量时可选择长胶条。2..选择pH为3-10的胶条可观察细胞总蛋白的分布，并可分离尽可能多的蛋白质。而使用窄pH范围(如pH6-7)能更精确研究这一感兴趣pH范围的蛋白质。3.对于一个未知样品，可先使用较宽pH范围的胶条来找出所需蛋白质的位置，然后再用合适的窄pH范围的胶条更好地分辨这些蛋白点。 IPG胶条经再水化和加样后可进行第一向等电聚焦。通常的聚焦参数包括时间、温度和电压。合适的聚焦时间取决于样品量、胶长和pH范围等。聚焦的温度最好在20℃左右。因为温度过低(4℃以下)，尿素会结晶失去其原有的作用；而温度过高则会造成尿素结构的破坏，产生异硫氰酸盐而使蛋白发生氨基甲酰化，最终导致蛋白质等电点的改变。在等电聚焦过程中通常先设置低电压促使样品进入凝胶和去除过量