一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征.docVIP

一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征 摘要：中肠是昆虫的一个关键屏障，围食膜（PM）在防止外部侵入中起重要作用。PM蛋白质，PM的主要组成部分，确定该膜的结构和功能。从草地螟幼虫的PMLstiCBP的全长cDNA为2606 bp的长度，并包含一个2403 bp的开放阅读框是前蛋白编码一个808个氨基酸的具有15个氨基酸的信号肽cDNA的推导蛋白质序列包含8个富含半胱氨酸的结合结构域（CBD的）。重组LstiCBP用重组质粒DNA成功地表达在BL21细胞和表现出较高的几丁质结合活性同时在转录和翻译水平检测中肠LstiCBP表达然而，LstiCBP在草地螟的生化和生理功能需要进一步调查病毒，细菌，原生动物和蠕虫在微生物和昆虫的共同进化的过程中，一些微生物形成若干机制破坏PM与此同时，许多因素的影响，例如，Pseudaletia unipuncta GV（PuGV）增效，几丁质酶，calcoflour和凝集素，可以破坏PM的形成和提高病原体感染昆虫因此，作为病原微生物天然屏障昆虫PM主要由蛋白质和几丁质结合活性作为其典型特征表征将有助于发展虫害管理目标，以及提供更好的理解PM的功能和发展四类PM蛋白质基于该蛋白质不同条件下1类蛋白是那些可以生理，2类PM的蛋白质温和的洗涤剂，第3类蛋白包括那些仅由强变性剂和类蛋白质是不提取，即使是强这些蛋白质通常具有几丁质结合结构域PM蛋白质的结构特征主要集中在以下几类：，无脊椎动物肠粘蛋白和蛋白质与脱乙酰酶域所述含有60-75个氨基酸残基，并且其特征在于，半胱氨酸残基的和一个芳香族氨基酸所述保守的半胱氨酸残基认为形成域内二硫键有助于蛋白质蛋白酶富肠道环境昆虫肠粘蛋白（IIM）是一种高度糖基化的粘蛋白样蛋白非常强烈地结合在Trichoplusiani幼虫[10,29]中确定的，它包含peritrophin-A结构域。几丁质脱乙酰酶（CDA; EC3.5.1.41）是催化在几丁质和脱的N-乙酰葡糖的乙酰基的水解，从而产生葡糖胺和乙酸水解酶草地螟，草地螟属（鳞翅目：螟蛾科），是一种多食性害虫，它以35科200种植物和农作物，如玉米，大豆，马铃薯，甜菜，向日葵等它几乎每年都造成了严重的经济损失，并成为最严重的害虫在亚洲，欧洲和北美在这项研究中，我们从草地螟幼虫cDNA文库筛选一种新的被命名为LstiCBP 新型PM蛋白质表现出强的几丁质结合活性，这使得该蛋白草地螟的CBPcDNA克隆 利用cDNA末端（RACE）-PCR快速扩增2606 bp的CBP cDNA（图1（GenBankFJ408730所述LstiCBP cDNA的开放读框（ORF）包括2403个核苷酸，编码含有801个氨基酸的前体蛋白的ORF是由一个TAA终止密码子终止之后是一个富含AT的非编码区和推定的聚腺苷酸化信（TATATAA）位于polyA尾的上游69个碱基（图1）推导的蛋白序列显示有15个氨基酸的信号肽，如SignalP软件LstiCBP编码蛋白计算出的分子量和等电点分别为84.7 kDa的和4.14LstiCBP的亲水性，这是类似的其他昆虫CBPs计算并绘制序列中的每个残基，其中显示，8残区域均疏水该LstiCBP进行分析，以确定它糖基化类似于IIM，并NetNGlyc1.0分析表明LstiCBP只有三个N糖基化使用在线序列确定了胰蛋白酶和蛋白酶切割位点其中胰蛋白酶裂解位点和糜蛋白酶切割位点在LstiCBP该核苷酸序列为L. sticalitis CBP和其推导的氨基酸潜在的多聚腺苷酸化信号序列双线。结合结构域从N-下划线至该蛋白质的C-末端 蛋白质是PM的主要，以及这些蛋白质的几丁质纤维已被是在PM的形成很重要在这项研究中，我们发现了一种新PM几丁质结合蛋白CBP，这种蛋白质是从草地螟的非归一化的肠cDNA表达文库发现，这是在与先前的观察一致，该大多数PM蛋白质是几丁质结合蛋白LstiCBP是未糖基化的在鳞翅目幼虫，胰蛋白酶和糜蛋白酶都肠的主要酶出人意料的是，LstiCBP潜在胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点，但该蛋白质胰蛋白酶降解具有很高的耐LstiCBP序列的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的分析表明，大部分在几丁质结合结构域这个观察结果与早期报告显示，大多数胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点受到保护，防止肠消化蛋白酶几丁质结合结构域，这是非常重要的，因为PM蛋白质富含蛋白酶环境中发挥作用LstiCBP的特征几丁质结合域 LstiCBP与已知的昆虫CBPs，TniCBP1，TniCBP2，SexiCBP和SlitCBP比对示于图2。鉴定LstiCBP类似于大多数鉴定PM蛋白，并且其特征在于其包含多个结合结构域，半胱氨酸残基的保守以及由多个芳族氨基酸残基[2]，8富含半胱氨酸的区中每一个具有6个空间上保守的半胱氨酸残基形成