抗体人工制备要点分析.pptVIP

河南科技大学动物科技学院程相朝 河南科技大学动物科技学院 程相朝 抗体的人工制备 一、多克隆抗体（第一代抗体） 采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径注入动物体内后，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）。 该抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性，即针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同B细胞克隆产生的不同质的抗体所组成。 制备过程 二、单克隆抗体（第二代抗体） 由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）克隆、产生的针对单一抗原决定簇的抗体，或者说是由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体（moncolonal antibody, McAb）。 其抗体结构高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，而且具有纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应等特点，已广泛应用于生命科学的各个领域。如血清学检测诊断。 基本制备原理 1975年Kohler和Milstein首创了小鼠B淋巴细胞杂交瘤细胞和单克隆抗体技术。 1、小鼠骨髓瘤细胞在体内、体外可无限增殖，但不能分泌抗体； 2、经抗原免疫的小鼠脾细胞（含有大量B细胞）能产生抗体，但在体外不能无限增殖； 3、将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂50%聚乙二醇（PEG）作用下进行融合； 4、融合后转移到HAT选择培养基未融合的脾细胞因不能在体外存活而死亡，未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被氨基喋呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT），不能利用次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡，而融合细胞由于从脾细胞获得HGPRT，故能在HAT培养基中存活和增殖。 5、融合后的杂交细胞系称为杂交瘤（hybridoma）,这种杂交瘤细胞即具有骨髓瘤细胞能大量无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌抗体的能力； 6、对融合后的杂交瘤细胞，应尽早进行克隆化，一方面是保证以后获得的杂交瘤细胞是由一个细胞增殖而来的，即单个克隆，另一方面防止杂交瘤细胞因染色体丢失而丧失分泌抗体的能力，常用方法有有限稀释法，显微操作法等； 7、加入二甲基亚砜分装于小安瓿瓶内保存于液氮中。 8、采用动物体内生产系统或细胞培养生产系统进行批量生产。 细胞操作间及无菌操作台 所用细胞培养器皿都要无菌： 首先用重铬酸钾硫酸浸泡24-48h 用自来水冲洗7-10次 再用去离子水洗2-3次 再用超超水洗2-3次 接着用160°C烘烤2h，最后高压灭菌， 然后用锡箔纸或牛皮纸包裹即可备用 免疫动物脾细胞制备过程 细胞融合后培养注意点 96孔培养板要先加小鼠的腹腔巨噬细胞作为试养细胞， 为已融合的杂交瘤细胞培养提供细胞密度和细胞生长因子 三、单克隆和多克隆抗体的比较和用途 三、基因工程抗体（第3代抗体） 随着DNA重组技术以及其他分子生物当技术的发展，人们通过基因工程技术对Ig分子进行切割，拼接或修饰来制备的新型抗体分子，称为基因工程抗体（genetic engineering antilody）。 基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子，可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性，去除或减少无关结构（如Fc片段），从而克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷. 基因工程抗体的制备过程 获得抗体基因片段 导入真核细胞 导入原核细胞 （杂交瘤细胞） （大肠杆菌） 表达具备免疫活性的抗体片段 常见的基因工程抗体有:嵌合抗体、重构抗体、单链抗体等。 复习思考题 1、单克隆抗体及其制备的基本程序。 2、基因工程抗体的概念 * * * * 抗原制备 动物免疫 检测血清抗体效价 多抗纯化与标记 血清分离与保存 B 动物免疫过程 第一次免疫 用抗原+弗氏完全佐剂 第二次免疫 一免2或4周后用抗原+弗氏不完全佐剂 第三次免疫 二免2周后再抗原+弗氏不完全佐剂 三免一周后，用断尾或摘眼取血，检测抗体效价，待抗体效价达29-10即可 注意：所获得的抗体可以作为阳性血清，用于后期单克隆抗体筛选的阳性对照 B McAb 特异性 敏感性 均一性 PcAb 低 差 无 高 强 有 1、用于免疫学检测，辅助临床诊断 2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原 3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等 4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。 原理 种类 基因工程抗体种类 基因工程人源化抗体生产示意图 * * *