生化技术电泳教案解析.pptVIP

二、尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (一)特点 当用含尿素的变性PAGE检测膜蛋白或核酸样品时，膜蛋白的溶解度可以增高，核酸样品中的核苷酸碱基配对能被抑制 (二)应用 该法既可用于DNA探针和酶解核酸产物的分离、制备，也可用于核酸的序列分析 (三)操作 1．样品制备 2．变性PAG板制作 3．电泳 4．凝胶的干燥与曝光 （2）光催化聚合原理 该系统的催化剂是核黄素，核黄素在氧和紫外线作用下，生成含自由基的产物，即可活化丙烯酰胺单体形成凝胶（此系统可不加TEMED，但加入TEMED会使聚合速度加快） 缺点：光聚合形成的凝胶呈乳白色，透明度较差 优点：①催化剂的用量极少，对分析样品无不良影响 ②聚合时间可通过改变光照时间和强度来把握 化学聚合与光聚合比较 化学聚合的凝胶孔径比光聚合的小，重复性和透明度也较好；但化学聚合的引发剂为强氧化剂，残存于凝胶中往往会使某些蛋白质分子丧失活性，或者产生畸变的电泳图谱 （二）PAGE的分离原理 1.浓缩效应 在电泳初期，盐酸几乎全部解离出Cl-,Gly(pI=6.0)只有0.1~1%解离释放出Gly-,而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为pro-.三种离子带相同性质的电荷，并同时想阳极移动，其有效泳动率为 ，式中m代表泳动率，a代表解力度，ma代表有效泳动率。电泳进行时， Cl- （快离子）移动速度快，其后形成一个低离子浓度区域，即低电导区域或高电场强度区域（电场强度与电导成反比），致使pro-和Gly-加速移动；当三种离子的泳动速度相同时，在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面 由于pro-的有效泳动率恰好介于快离子和慢离子之间，因而就聚集在此移动界面附近，并浓缩成一个狭窄的中间层（其浓缩的程度与样品本身的浓度无关，而与系统Cl- 浓度成正比） 2.电荷效应 带电颗粒在电场中的泳动速度与其本身所带的电荷量成正比，与颗粒的分子质量成反比 3.分子筛效应 第三节 琼脂糖凝胶和半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(作支持物)电泳法进行的。但有时特别是当分离核酸和测定其分子质量时，也可采用琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行 用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离线性DNA(L-DNA)时，其迁移率与该物分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成却无关(这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在) 若用聚丙烯酰胺凝胶分离核蛋白时，应在低浓度聚丙烯酰胺凝胶(约2.5％)中掺人适量的琼脂糖,这样既能增大凝胶的强度，又可提高分辨率。其凝胶配制方法见表18-24 一般在进行核酸类物质的分离、鉴定时，使用较纯的无电渗力之琼脂糖为宜，而在实施这类物质的制备或回收时，则选择低熔点的琼脂糖较好。其原因是，前者熔点是80~90℃，此温度会导致双链DNA解链。而后者熔点则＜65℃，30℃即可形成凝胶，此温度不会破坏天然DNA结构 一、琼脂糖凝胶电泳 1．缓冲液的配制 ①除去二价金属离子 ②硼酸与琼脂糖易形成复合物，使凝胶带负电荷，可能会吸附带正电荷的物质 在配制电泳缓冲液时，都需加适量的EDTA， 其原因是 2．琼脂糖胶板的制备 ①称取一定量的琼脂糖盛入玻璃瓶中，按所需凝胶浓度加适量的电极缓冲液，用棉塞将瓶口塞紧 ②置消毒锅(4.4×104Pa)处理15min，或在沸水浴中加热熔化0.5h，或在微波炉熔化(时间不宜长) ③待溶液冷却到60℃左右，加入溴化乙锭溶液(取自用蒸馏水配制的10mg／ml的贮备液，4℃存放)，令浓度为0.5μg／ml，摇匀 ④将“梳子”固定于玻板适当位置上，倒胶，使其厚度为3mm ⑤室温放置30~45min后，小心地移走“梳子”和模框，即制成了琼脂糖凝胶板 3．加样和电泳 将琼脂糖凝胶板平移至水平式电泳槽中，注入缓冲液(液面高于胶面)，接通电源，在负极端每平方厘米的样品孔(深≤3mm)中加核酸样品10~50μg，体积可达200μl(在此前，样品中应先加示踪染料，其配方见表18-26中)，当样品进入凝胶后，使其维持在6V／cm左右。当溴酚蓝(最常用的示踪染料)移至阳极端时，关闭电源 4．观察 　　取出经溴化乙锭(EB)染色的凝胶板，在254nm紫外灯下观察，存在核酸的部位呈现红色荧光谱带，欲照相时，须在相机镜头上加红色滤光片 未用EB染色的凝胶板也可用银染液或焦宁Y、甲烯蓝等试剂染色(其配方见表18-27)，用肉眼直接观察 5．应用实例 采