PCR和DNA测序资料.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3、巢式PCR Nested PCR 两套PCR引物 （巢式引物） 两轮PCR扩增 4、反向PCR 普通PCR只能扩增两端序列已知的基因片段， 反向PCR则可扩增中间一段序列已知，而两端序列未知的基因片段 5、锚定PCR 锚地PCR技术是 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 6、RT-PCR 反转录RCR（reverse transcription PCR,RT-PCR） 实时荧光定量PCR（real time PCR,RT-PCR） 7、RACE技术 RACE：快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification cDNA End)技术，获得全长cDNA的快速有效的方法。 RACE法就是通过向cDNA末端加尾，根据已知序列和加尾 设计引物扩增 获取cDNA末端未知序列的方法。 5‘ RACE 和 3RACE的原理不一样 Takara公司3 RACE和 5 RACE 试剂盒原理 3’RACE的局限性及注意事项 3’末端RACE相对容易，因为存在一个poly(A)，而且降解常不是从3末端开始的。 局限性： 细菌和一些病毒的基因组的3’末端通常没有poly（A），这个方法就不适用； 而且在有一些RNA中，这个poly(A)也容易丢失 解决办法：可以通过poly(A)聚合酶在末端加A即可 RNA中加入RNA酶抑制剂，很有利于保持完整的RNA 5’RACE的局限性 通常，提取的RNA都会有些降解，而RNA的降解是从5’端开始的，所以用5’末端磷酸化的RT-primer去拉的时候，5’末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该引物能将5’末端拉全。 Takara公司的5’RACE新方法 8、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR） 普通PCR技术的定性和定量分析： 定性：凝胶电泳的方法 定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析 对象：PCR扩增的终产物 普通PCR技术的局限性：无法获得某一转基因动、植物转基因的拷贝数 或者 某一特定基因在特定组织中的表达量 Real-time Q-PCR 简言之，利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线 特点：可以对DNA模板进行定量分析 具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、 能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、 具实时性和准确性等特点。 实时荧光定量PCR技术 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 RT-Q PCR 的应用 mRNA表达的研究，DNA拷贝数的检测，单核苷酸多态性（SNPs）的测定，病原体的检测，肿瘤诊断，基因突变、多态性及表达的研究，遗传疾病的诊断 RT-Q PCR 存在的问题 在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品； 实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了它的应用能力； 研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制； 相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内源控制物的选择也是实验结果可靠与否的关键； 不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）； DNA序列测定 DNA测序技术的诞生和发展 1980年， Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第2次获得诺贝尔化学奖 ） 1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977) 1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger 发明双脱氧链终止法DNA测序技术(Sanger和Coulson)，迄今为止 DNA测序技术的诞生（第一代DNA测序技术） Sanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。 第二代测序技术（Next-generation sequencing)：费用更低、通量更高、速度更快。 第二代DNA测序技术 现有的技术平台主要包括：Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。 三个技术平台各自的优点： 454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp； Solexa