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4. 模板（靶基因）核酸 传统的DNA纯化方法用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。 再用有机溶剂抽提除去蛋白质和其他细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，即可作为模板。 DNA模板的浓度一般1~10ng /?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 5. Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.6mmol/L反应体系。 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增；浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降。 PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 1）不对称PCR 目的：扩增产生大量的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。 高浓度引物 非限制性引物 低浓度引物 限制性引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR 用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 引物 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 可同时检测多种基因成分 特别适合大量临床标本的基因诊断 4）LP-PCR（Labelled primers) 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 5）ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 mRNA PCR扩增 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ 3’ PCR常见问题 无扩增产物 拖尾 假阳性 PCR常见问题、问题分析及解决方案 PCR常见问题之一 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：变性温度低，退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 提高变性温度，降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； PCR常见问题之二 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 PCR常见问题之二 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多、酶质量差 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 PCR常见问题之三 假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 第五章 PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应 People’s Choice Reaction 分子生物学研究中最强大的实验技术之一 本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家 穆利斯（K.B.Mullis） 发明了PCR技术 1993年诺贝尔奖 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解链酶 DNA 解旋解链 合成引物 子链延长 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ D