04聚合酶链式反应扩增.pptVIP

2004级应用生物教育专业 2005-4-12 2003级生物科学专业 2005-2006(上)分子生物学实验 二、实验原理(Experimental Principle) Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a sequence of DNA, using a pair of oligonucleotide primers each complementary to one end of the DNA target sequence. These are extended towards each other by a thermostable DNA polymerase in a reaction cycle of three steps: denaturation of template, annealing of primers and extension of the primers. A typical amplification reaction includes Primers (引物) Template DNA (模板DNA ) Taq DNA Polymerase (Taq DNA聚合酶) Nucleotides （寡核苷酸, dNTP） PCR buffer (PCR缓冲液) 三、试剂与器材（Reagents and apparatus） Ⅱ. Reagents 1. Sterile water 无菌水 2. 10×PCR buffer 10×PCR缓冲液 3. 25 mM MgCl2 氯化镁 4. 10 mM dNTPs 单核苷酸 5. 50μM oligonucleotide primers 1 677F 引物1 6. 50μM oligonucleotide primers 2 677R 引物2 7. 5 unit/μl Taq DNA polymerase Taq DNA 聚合酶 8. Template DNA 模板DNA 模板DNA: 人淋巴细胞提取的DNA（指导合成亚甲基四氢叶酸还原酶基因片段） 。 Taq DNA聚合酶: 天为时代工程公司生产，含10×反应缓冲（100mMTris.HCl,PH=9.0,500mM KCl，不含MgCl2 ），MgCl2溶液（25 mM）以及Taq酶（500 U），-20℃贮存。 引物1 677F: 5’TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA 3’ 引物2 677R: 5’AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3’ 以上引物由英骏生物技术有限公司合成。基因片段的上、下游引物合成产量为1 OD，离心后开盖加入灭菌三蒸水配成终浓度为50μM 的溶液，20μl分装后于-75℃贮存备用。 四、实验步骤(Experimental Procedures) 1.Combine the following for each reaction in a PCR tube (0.2ml） [在PCR (0.2ml）小管中将下列各组分混合]： 2. Prepare a control reaction with no template DNA and an addition 35.5μl of sterile water. [设立对照反应，其中不含模板DNA，而加35.5 μl 无菌水。] 3. Run the following program: [按以下程序运行] 95 ℃ preheated 8 min 95℃ 1 min. 62℃ 1 min. 72℃ 1 min for 36 cycles. Program a final extension at 72