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RT-PCR简介 点2815??作者： ??来源：? 时间： 2007-03-07 　本站 主要内容RT-PCR原理RT-PCR步骤常 两RT-PCR一RT-PCR两RT-PCR比 RT-PCR主要用途分析基因的获取目的基因合成cDNA探逆AMV：禽成髓RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆RNA酶H活性37℃，最新版本42 （Super RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反RNase H-突RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）RNase H的作用水解RNA-DNARNART-PCR引物的随机引物：适用于RNA,特异性最低。起始20μl体系50-250μg。Oligo(dT15-18)：适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始20μl体系0.2-0.5μg。特异性引物：与目的序列互20μl体系1pmol。提高RT-PCR灵敏度1.分离高RNA 2.使用无RNaseH活性的逆3.提高逆 4.减少基因DNA污染RT常 PCR与RT-PCR技 点5819 ?? 作者：?? 来源： 日期：2007-03-07?? ?本站论坛 PCR基础 聚合PCR）DNA序列。20-30个循1）。模板可以DNA；由RNAcDNA；或未Taq DNA聚合其他PCR产物的熔点（Tm），忠PCR的影响。 表1. 反应成分 Component Final Concentration Template 10^4-10^6 copies of DNA template Primer 1 0.1-0.5μM Primer 2 0.1-0.5μM 10X Reaction buffer 1X Magnesium 1.0-3.0mM dNTP mix 200 mM each dNTP Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR基础 RT-PCR将以RNAcDNA合成同PCRRT-PCR用于cDNA文cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保S1核酸RNA分析技 RT-PCR的模板可以RNA或poly(A) RNA。逆oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一RT-PCR中，cDNA的合成首先在逆1/10的反PCR。在一RT-PCR中，逆PCR在同PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 图1. RT-PCR概 ? 增加RT-PCR灵敏度 分离高RNA 成功的cDNA合成来自高RNA。高RNA至少EDTA或SDS。RNA的cDNA上的序列信息量的最大RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol100个1mg组织中提取RNA。 TRIzol? 一般不必使用oligo(dT)poly(A) RNA。不管起始模板是RNA还是poly(A) RNA，都可以2）。另外，分离poly(A) RNA会mRNA丰度的波mRNA时，poly(A) RNA会增加 图2. 总RNA和poly(A) RNA在RT-PCR中的比 以5或1μg HelaRNA（分1和2）或500ng和50ng Helapoly(A) RNA（分3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScript逆cDNA。DNA聚合εmRNA 5端377bp片段和A mRNA的643bp片段，两者都将1/10的cDNA合成反Taq DNA聚合30个循 ? ? ? 为了防止痕量RNase的RNase的RNA需要RNA，RNA，在水中脾RNA，在水中保存3年仍保持4kb的RNase的降解比小RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲-70℃。用于保存RNA的甲RNA的RNA至少可以在甲RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体3-5分10,000×g离心5分 在逆RNase抑制cDNA合成的RNase抑制DTT）存在的条件下加入，因cDNA合成前的RNA的RNase。蛋白RNase抑制RNase A，B，CRNA的降解，并不能防止皮RNase，因此尽管使用了RNase。 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆 逆RNA转化成cDNA。不管是M-MLVAMV，在本身的聚合RNaseH活性。RNaseH活性同聚合RNA模板与DNA引物或cDNA延伸RNA：DNARN