基因工程主要内容及流程技术报告.docVIP

基因工程制药 姓名：刘惠霞 学号：2011506024 班级：2011级生技1班基因工程制药 一．基因工程制药常用的工具酶： 基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。 (一) 限制酶(Restriction enzymes) 限制酶即限制性核酸内切酶的简称，是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。 限制酶的种类 Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。 Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。 (二) DNA聚合酶(DNA polymerase) DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。 1．大肠杆菌 DNA聚合酶Ⅰ 2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 5. TaqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶 6. 反转录酶 （三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。 1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5羟基之间形成磷酸二酯键。 2. 大肠杆菌DNA连接酶： 用途较窄，不常用。 （四） 基因工程中常用的其他酶 1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶） 2. T4噬菌体多核苷酸酶 3. 核酸酶（Nuclease） 4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA分子中的5 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。 二． 基因工程制药中常用的克隆载体 载体：能在细胞内进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。 （一） 质粒 1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。 2 常用的几种质粒载体 （1）pBR322及其衍生载体 pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。 BamH I等10个切点位于Tetr基因内，Pst I 等6个切点位于Ampr基因组内，EcoR I位点位于这两个基因之间，有利于检出重组转化子。 PAT153载体：用限制酶Hae Ⅱ进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带动的较小质粒载体（3.66kb），拷贝数比pBR322增加1.5～3倍。 pBR327载体：用EcoR Ⅱ部分酶切pBR322，去除非必需区段（位点1442~2502）后构建而成。长仅3.27kb；没有泳动功能；质粒拷贝数增加2～4倍。 (2) pUC系列载体 Ⅰ pUC18、pUC19质粒载体 含有pBR322的Ampr基因、复制原Ori和M13噬菌体M13mp系列载体所用的LacZ基因，在Lac区内有独特的限制酶识别位点组成的多聚接头顺序（即多克隆位点），这两个载体不同之处在于多克隆位点以互为相反的方向排列。pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的mop基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高的多。pUC18/19载体能表达LacZ基因产物（β－半乳糖苷酶）的氨基端片段，在相应的宿主（Lac-）中可出现α互补。 Ⅱ pUC118、pUC119质粒载体 Ⅲ pUC的衍生质粒载体：pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z等。 （二） λ噬菌体 1 常用的λ噬菌体载体 （1） Charon系列载体 为克隆DNA大片段而设计的替换型载体。代表性载体有：Charon4A、pCharon21A(早期)、Charon32～35和Charon40等。 （2） EMBL系列载体 克隆大片段基因组DNA的替