DNA重组技术概述(86页)….ppt

基因表达的分子生物学基础 质粒DNA的提取及鉴定 1．收获细菌 2．碱裂解法小量抽提质粒 　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。 　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。 　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀 　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀DNA，室温放置2min。 　　（7）4℃以12000g离心5min。 　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。 　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。 　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。 聚合酶链反应（PCR） Polymerase Chain Reaction 基本原理： 变性、 退火、 延伸 大肠杆菌感受态的制备 （1）接种单菌落于