enzymologyc蛋白质浓度测定资料.pptVIP

人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * 首先了解样品的性质一般性质：试样的体积、酶（蛋白质）和杂质的量、试样的pH及离子强度酶的物化特性：大小、pI、S(solubility)、亲水性、化学性质酶的生化特性：稳定性、辅助因子 第六节 酶纯化步骤的设计 考虑相容性A.开始阶段样品体积、数量大 首先考虑高容量capacity，其次高分辨率resolution处理量小时则反之B.盐析后盐浓度高，影响离子交换色谱和电泳，需先进行透析或凝胶过滤脱盐。 1.分离方法的顺序 C 分离的每个步骤选择不同性质的分离方法 D 最后分离条件注重复原性、快速，因为蛋白质越纯稳定性下降越快。 2.初步纯化一般注意点：A. 温度B.避免极端I,pHC.有机溶剂D.蛋白质的浓度（高 稳定，因为蛋白质带负电，排斥力大）E.避免泡沫和膜的形成F.酶的活性 6.纯化步骤的定量评价 3.选择性的纯化步骤 色谱法 4.检查纯化的进展情况 常用电泳（PAGE, SDS, IEF） 5.进一步纯化 根据4结果，若分子大小差异——GEC 若电荷差异——离子交换色谱 7.在纯化过程中酶活力的损失主要原因：蛋白质变性 避免方法：改变温度和pH 其他原因：辅助因子被去除 第七节 蛋白质浓度的测定  凯氏定氮法 双缩脲法 福林（Folin)-酚试剂法 考马斯蓝染色法 紫外光吸收法 Determination of enzyme activity Enzyme activity （酶活力，酶活性） Active unit（酶的活力单位） Specific activity（酶的比活力） Enzyme activity 定义指酶催化一定化学反应的能力用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应速度（初速度）来表示 方法测定产物增加的量或底物减少的量eg. 化学滴定、比色、测定紫外吸收、荧光测定 Active unit （U） 国际单位1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。特定条件：温度—25oC 其他条件（eg. pH及底物浓度）均采用最适条件。 习惯用法eg. ?-淀粉酶，用每小时催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量来表示。 实例 ?-淀粉酶，?-淀粉酶 果胶酶 蛋白酶 脂酶 过氧化物酶 (POD) 多酚氧化酶 (PPO) 脂肪氧合酶  ?-淀粉酶活力测定方法碘显色能力下降的速度底物粘度下降速度糖苷键被打断的速度 ?-淀粉酶活力的测定方法麦芽糖形成的速度3，5-二硝基水杨酸、铁氰化钾或碱性铜盐溶液测定还原基团形成的速度 果胶酶活力的测定 PE (pectin esterase果胶酯酶)： 滴定法(pH-stat法) PG (polygalacturonase聚半乳糖醛酸酶)和PMG (polymethylgalacturonase聚甲基半乳糖醛酸酶)（为内切酶时）：粘度法 PMGL （polymethylgalaturomide lyase聚甲基半乳糖醛酸裂解酶） PGL（ polygalacturonmide lyase聚半乳糖醛酸裂解酶）：降解产物的C4和C5之间形成双键，在235nm处有吸收。 蛋白酶活力的测定 蛋白质 酶 肽 原理： 根据蛋白质经酶作用后在一定浓度的三氯醋酸（TCA）溶液中溶解度的变化来确定酶的活力。 肽的含量测定： 紫外分光光度法 显色法（茚三酮、双缩脲试剂、福林酚试剂） 国标 (QB547-80) 原理：蛋白酶水解酪蛋白，其产物中含酚基的氨基酸在碱性条件下能被福林 (Folin) 试剂还原，生成蓝色化合物，从蓝色的深浅测知酶活力的大小。 底物：0.5%酪蛋白 缓冲溶液：0.02M，pH7.5PB 酶液配制：精确取定量的酶粉100mg，加少量缓冲液研磨，定容100ml，离心，取上清液10ml定容100ml。 酶活力测定：酶和底物分别于30℃水浴保温，取出2ml底物加入稀释的酶液1ml，立即混匀计时，反应15min，立即加入3ml 10%TCA终止，室温静置半小时，过滤，取1ml滤液用Folin-phenol法测定可溶性蛋白质，680nm比色。 中性蛋白酶AS1398 活力的测定