蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用要点讲解.doc

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用荧光素FITC标记抗体纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质 → FITC-NS-C-N-H2-蛋白质FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记 　　(1)试剂和材料 0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaC18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水 　　0．mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法 取0．5mol／LNaCO3(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。 　　3％碳酸钠水溶液配法 称5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。 　　其他试剂和材料 l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。 　　(2)方法及步骤 取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质mg，缓冲液为总量的10％，降温至4。 　　加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4下电磁搅拌12～14h。 　　然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。 　　将制备好的荧光抗体加叠氮化钠01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4)可以用半年以上，20℃保存可达2年以上。 　　4．透析标记法 此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。 　　(1)试剂和材料 试剂和材料同改良法。 　　(2)方法及步骤 用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。 　　用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。 容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4中。 FITC CAS#：3326-32-7 中文名：异硫氰酸荧光素 英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC ? ? 结构式： ? 分子式：C21H11NO5S 分子量：389.38 性质： 1. 外观：黄色粉末 2. 纯度：≥95% (HPLC) 3. 产品描述： ????? FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为525～530nm 4. FITC标记抗体流程： 1）将待交联的蛋白（浓度≥2mg/mL）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36gNaCl，加水定容至1L。 （2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。 （3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:50μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。 （4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L（稀释100倍），4℃终止反应2 h。 （5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。 （6）交联物的鉴定 蛋白浓度(mg/mL) = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4 F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。 （7） FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4避光保存。 储存条件：4避光