血红蛋白的提取和分离重点解析.pptVIP

* 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，每个基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 课题3 血红蛋白的提取和分离 一、基础知识: 预习提纲： 1.不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？蛋白质的提取和分离的方法有哪些？ 2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是什么？ 4.什么事缓冲液？它的作用是什么？ 3.凝胶电泳法分离蛋白质的原理是什么？ 一、蛋白质提取和分离原理 蛋白质的物理化学性质： 形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。 提取分离方法 凝胶色谱法 (凝胶)电泳法 (一)凝胶色谱法 （1）原理 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 （2）分离过程（简述） 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 (一)凝胶色谱法 1.原理： 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小 不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向 和运动速度不同。 (三)电泳--凝胶电泳法 二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 返回 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ ①目的分析： ②蒸馏水的作用是______________________________。 ③加入甲苯的作用是____________________________。 ④充分搅拌的目的是____________________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 3.分离血红蛋白 分离过程 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂类物质 烧杯 甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体 杂质沉淀层（暗红色） 试管中溶液层次 4.透析血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL 利用透析袋透析 透析过程 纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 教材图5－19 3.样品的加入和洗脱 装配好的凝胶柱 1.分离血红蛋白时，选择鸡血细胞还是猪血细胞好？为什么？若是提取DNA呢？ 2.与真核细胞其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点，这一特点对分离有什么意义？ 1.猪血好，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，血红蛋白含量高 2.选鸡血，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，DNA含量低 思考与讨论 血红蛋白时有色蛋白，在凝胶色谱分离是可以通过观察颜色来判断什么时候收集洗脱液。 知识总结 血红蛋白的提取和分离 蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 蛋白质的 提取分离 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 教学反馈 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白 B B B A 5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.