DNA重组技术的基本工具(高三任晓东)解读.ppt

DNA重组技术的基本工具 2008年普通高等学校招生全国统一考试（海南） 26、（18分） 图为某种质粒表到载体简图，小箭头 所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI 的酶切位点， ampR为青霉素抗性基因， tctR 为四环素抗性基因，P启动子，T为终止子， ori为复制原点。已知目的基因的两 端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种 酶的酶切位点。 据图回答： （1）将含有目的基因的DNA与质粒该表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用ＤＮＡ连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。 （2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ； （3）在上述实验中，为了防止目的基因和基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。 基因工程需要哪些特殊工具？ 分子手术刀—— 限制性核酸内切酶 　 　 ⑴有一或多个限制酶切点 ⑵有一个或多个标记基因， 便于筛选 ⑶导入基因能在受体细胞 中复制、表达 ⑷对受体细胞无害 在实际操作过程中，载体的这些特点 能否满足实际需求？ 多个EcoRI酶切后的载体与目的基因混合之后， 加入DNA连接酶，其连接产物是否只有一种？ 载体与载体之间的连接 目的基因与目的基因之间的连接 如何解决目的基因定向插入的问题呢？ 提示： 载体的特点之一：有多个不同的酶切位点。 一.载体含有多个酶切位点。 二.双酶切： 1.保证目的基因的定向插入。 2.提高DNA的重组率。 拓展提高——筛选含目的基因的重组DNA 如何筛选出含目的基因的重组DNA呢？ 提示：在基因工程的实际操作中，科学家选择的载体往往含有两 个或更多的标记基因。 如果在目的基因的插入位置有一个标记基因，当目的基因插入后，标记基因将被破坏而无法表达，从而达到筛选目的。 反向插入 ○ ○ 目的基因插入方向不同将导致出现不同的基因产物 材料： 两种限制酶切割产生的黏性末端不同 载体与载体间，目的基因与目的基因间仍可连接 载体及目的基因无法自身环化 正确连接 ○ ○ 无法连接 ↘ ↘ ○ ○ 载体特点中除有多个酶切位点外，还携带标记基因。 载体与载体重组DNA 载体与目的基因重组DNA * 广西人教版教材培训 任晓东 civility@163.com （2010年江苏）27．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶 的酶切位点。请回答下列问题： （1）一个图1所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有 ▲ 个游离的磷酸基团。 （2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越 ▲ 。 （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna Ⅰ切割，原因是 ▲ 。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在 于可以防止 ▲ 。 （5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 ▲ 酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 ▲ 。 （7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌 突变体，然后在 ▲ 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。 【答案】（1）0、2 （2）高 （3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 （4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 （5）DNA连接 （6）鉴别和筛选含有目的 基因的细胞 （7）蔗糖为唯一含碳营养物质 培养学生能力 重视基本的生物科学技术概念 在学生原有知识经验基础上提升 充分利用课程资源和信息技术 创设学生主动参与学习的机会 DNA重组技术的基本工具 分子运输车——载体 分子缝合针——DNA连接酶 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 将两个相同的黏性末端之间连接起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E·coli DNA连接酶　　　　　　　　 载体的特点： EcoRI酶切后的载体和目的基因 目的基因 载体 载体与