冷冻精液技术与动物育种教案详解.pptVIP

冷冻精液技术与动物育种 汇报人：李胜敏 背景 精液冷冻保存是指将采集到的新鲜精液，经过特殊处理，利用液态氮（-196度）作为冷源，以冻结的形式保存于超低温环境下，进行长期保存。精液冷冻保存是比较理想的保存法，对现代畜牧的发展具有十分重要的意义。 精液冷冻保存的的意义 1.可充分提高优良种公畜的利用率 2.便于开展国内外种质交流 3.可使发情母畜配种时不受时间与地域限制 4.可推动繁殖新技术在生产上的应用 5.是建立动物精液基因库的重要手段 精液冷冻保存原理 精子受温度变化直接影响其本身活动力和代谢能力，精液在经过特殊处理后，保存在超低温下，精子的代谢活动完全受到抑制，其生命在静止状态下长期保存，当温度回升后又能复苏，且具有受精能力。 精液冷冻过程中面临的问题 冰晶是造成精子死亡的主要因素。 1.物理伤害 冰晶化是水在一定温度下，水分子重新按几何图形排列形成冰晶的过程。在此过程中，精子中水分体积增大且形状不规则，由于冰晶的扩展和移动，造成精子膜和细胞内部结构机械损伤，引起精子死亡。 2.化学伤害 由于冰晶的生成使得精子膜内的溶质浓度和渗透压增高，水由精子内向外渗透，造成精子细胞脱 水，从而精子细胞发生不可逆的化学毒害而死亡。 然而只有精子在0~-60度温度范围内才会发生冰晶化，降温越慢冰晶越大，在-15~-25度时形成冰晶最多，对精子危害最大。 在-60~-250度形成玻璃化冰冻状态，这个阶段对精子无害。 冷冻前精液预处理 精子的优选 不同物种或同一物种不同个体间的精液品质有很大的差异。一般情况下，冷冻前精液质量越高，解冻后精子的活力会越好 。目前，常采用的优选方法有离心法和上游法。 离心法：普通的离心处理可以去除精液中的 精浆和上皮细胞，而密度梯度离心法，可以根据 精子的密度将不同活力、形态的精子进行分离。这样能够有效地富集有活力、形态正常的精子，去除杂质细胞和死精子，同时分离出遗传物质不正常的精子 预冷冻 冷冻前进行预冷处理，其目的是保证精子有一段适应低温的过程，同时又能使渗透性防冻剂充分渗透进精子细胞内发挥作用，减少、甚至避免精子的冷休克损伤， 进而起到抗冻保护作用。目前，常采用的方法是水浴平衡法，一般从室温降到4℃或5℃， 便于精子以改变质膜结构来适应低温环境。对防冻剂毒性不太敏感的精子，直接将防冻剂加入到稀释液中，保证防冻剂充分进入细胞内， 达到保护精子免受损伤的作用；对防冻剂表现出毒性的精子，通常先用无防冻剂的冷冻稀释液稀释精液，并添加一定浓度的卵黄或脱脂奶，在低温条件下加入含防冻剂的冷冻液，并在低温环境中平衡一定的时间，以保证防冻剂充分进入细胞。 稀释液 冷冻稀释液 主要包括两性离子、果糖、Tris卵黄缓冲液、Tris-Tes卵黄缓冲液、柠檬酸盐、TEST柠檬酸盐卵黄缓冲液等。其主要作用是优化精子所处环境的渗透压与pH值， 为精子提供能量，防止精子细胞内磷脂的流失并起着防冻剂的作用，防止细菌污染，去除高度稀释对精子的负面影响，给精子适应外界环境创造有利条件 。 目前常用的冷冻稀释液有：灵长类的TTE和TEST、马的INRA96、牛的Triladyl（（R））、鸟类的EK、鱼类的盐溶液等 上游法：用于分离出有活力和无活力的精 子，增加精液中运动精子的百分率。同时，上游法可以去除精浆、无活力的精子、杂质细胞、无定形物质等，避免精子获能和发生顶体反应，有效的改善冷冻精子的运动特性、顶体状态和质膜完整性，提高精液品质 。相比离心去除精浆和死精子而言， 上游法具有不造成精子亚致死性损伤的优点。 防冻剂 适当防冻剂的加入，可以有效减少精子冷冻过程中的冷冻损伤。常用的防冻剂主要包括两大类：渗透性防冻剂和非渗透性防冻剂。渗透性防冻剂是一类含有-OH基的小分子化合物，如甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇等，它们可以自由通过细胞膜；非渗透性防冻剂是一类不能透过细胞膜的大分子物质，如卵黄、糖类、脂蛋白等，主要增加细胞膜结构的稳定性和缓解冷冻损伤。 精子冷冻方法 目前，根据降温速率和降温程序的不同将冷冻方法主要归结成五种类型： 快速冷冻法 慢速冷冻法 玻璃化冷冻法 定向结冰冷冻法 干燥冷冻法 精子活力检测 质膜完整性  顶体完整性 染色质完整性 线粒体活性 功能检查 运动度 受精能力 前景与展望 精子冷冻保存在保护濒危动物种质资源多样 性、构建精子（基因）库、动物繁殖、不孕不育症治疗、避免非生殖季节原因无精子状况、以及增加受精研究的稳定性、便捷性等方面发挥着独特的作用。借助于辅