PCR技术应用进展及存在问题资料祥解.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 在血液筛检中的应用 HCV和HIV感染“窗口期” HBV DNA PCR检测筛检血液的意义 其 它 Immuno-PCR PCR应用存在的问题 病原体 遗传病 肿瘤 定量PCR测定的临床应用及应注意的问题：病原体 为什么要做定量测定？ 定性和定量测定结果报告上的混淆。 为什么要做定量测定？ 用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果的动态观察及抗病毒药物的临床研究；细菌、支原体、衣原体等一般不需要做定量检测。 用于基因表达方面的研究，如特定的mRNA的定量测定。 定量测定的结果报告 定量测定测定的是量的“多”或“少”.用于已知患者的抗病毒治疗的动态观察. 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。 定性测定 定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。 什么样的病原体感染用定性测定? 细菌性感染、一过性的急性病毒性疾病、支原体和衣原体感染、寄生虫病等。 遗传病检测的问题 认识的简单化、依赖于商品试剂盒 检测与临床结合不足 肿瘤检测的问题 滥用 没有经过批准的商品试剂 个体化治疗的检测问题 “概念” 基因芯片 “概念” 哪个项目需要多个指标同时进行检测的，这种同时检测能带来什么样的方便或快捷，并且将新方法与现有方法比较，有什么样的优点。 技术或方法的成熟程度 判断的最简单的方法：找3~5份含不同浓度特定分析物的临床标本，用其重复检测20次，观察结果是否一致，如出现不一致（哪怕是只有1次不一致），就不能用于临床检测。 临床PCR检验的标准化 方法试剂的标准化 核酸提取 “内标”(Internal control)的应用 工作程序的标准化 标本采集、运送、管理、检测、质量控制、结果报告和解释 标准物质的研究 临床PCR检验应用的发展趋势 核酸提取方法的简便化和自动化 项目的多样化：从病原体、到基因疾病的诊断、多标志物同时检测、疾病基因指纹 不同原理的实时核酸扩增仪的普遍应用 扩增试剂的改进：标准化、防污染、有内标阴性质控 临床PCR实验室质量理念不断增强 谢谢！ * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * PCR技术应用进展及存在问题 卫生部临床检验中心 李金明 PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow] Kary Mullis 什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) “… 真正惊人的是PCR完全不是为解决某一个难题而设计的,该技术成熟之后,它所能解决 的难题才开始涌现…” - 史蒂文·沙夫 PCR技术的特点：高特异性 引物的特异性。 引物延伸时，碱基配对的正确性。 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。 靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。 作为临床测定的PCR方法，还有一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探针。 PCR技术的特点：高灵敏度 从理论上，其能在2~3小时内，将1个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。 而就特定的扩增反应来说，从理论上，只要反应管中有1个分子，就能将其扩增至能检出的水平。如将一些干扰因素考虑在内，一个反应体系中，如有2~3个以上的靶分子，即可成功的通过PCR扩增，将其检测出来。 PCR技术的特点：简便快速 整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。 整个扩增反应可在2～4 小时完成。 特定的低纯度标本也可使用 某