CRISPR及在原核生物防御系统中作用的研究进展.docVIP

CRISPR及其在原核生物防御系统中作用的研究进展 摘要 近来在众多原核生物的基因组的分析中，发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）结构家族。CRISPR由一类DNA重复单元所构成，在功能上与DNA的重组、修复及原核生物的免疫防御系统关系密切。通过对于CRISPR及其相关系统（CASs）基因的比较性分析，CRISPR独特的结构和功能引起人们的广泛关注。实验表明CASs的插入序列来源于细胞内的许多染色体外遗传物质，并且以一种类似于真核生物中RNA干扰（RNAi）系统的机制，在原核生物抵抗入侵的噬菌体和质粒的防御系统中发挥着重要作用。本文综述了CRISPR系统的基本结构、多样性、作用机理及其区分自我与非我的机制，并对CRISPR研究和应用前景进行了展望。：CRISPR原核生物免疫 成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一类独特的DNA直接重复序列家族，广泛存在于众多原核生物基因（大多数的细菌和几乎所有的古细菌）中[1]。自2002年首次被人们所定义以来，CRISPR一直以其奇特的结构与特殊的功能吸引着各国科学家们的共同关注。它的结构非常稳定，长度约25～50bp的重复序列（这里我们称为repeats）被单一序列（这里我们称为spacers）间隔[2]。根据不同的研究结果，人们对CRISPR系统的生物学功能曾有过种种推测，最近人们发现Cas系统（CRISPR-associated sequences system，CASs）在原核生物中表现出某种获得性免疫功能，帮助细菌抵御病毒的侵犯，并和DNA的重组与修复有关[3]。2005年，3个研究小组分别发现一些CRISPR的间区序列是来自噬菌体或质粒等染色体外的序列，据此推断CRISPR系统能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力[4-6]。2007年，Barrangou等[7]通过实验证实了CRISPR系统的这一生物学功能。 随着细菌基因组学的发展，CRISPR的基本结构已逐渐被确定，由短的高度保守的repeat与长度相似的非重复的spacers序列间隔排列[11]所组成。Repeats是一组高度保守的短小序列，其长度一般为25至50个碱基对。Spacers与repeats的长度相近，约为26到72个碱基对。此外一组约由4～10个保守基因组成的序列被发现于CRISPRs周围，我们称之为CASs（CRISPR-associatedsequences，CASs）[11]。在CAS蛋白中已鉴定出核酸内切酶、核酸外切酶、螺旋酶、RNA-和DNA-结合等结构域，因此，认为CAS蛋白参与CRISPR的转录、加工和外来基因序列的降解等过程[3]图1 在已测序的约40%细菌和90%古细菌基因组中至少存在1个CRISPR座位(locus)，古细菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)中存在18个CRISPR座位，是目前已研究的原核生物中最多的[8]。每个CRISPR座位具有几个到几百个R-S重复单位(图1-A)，平均为66个，目前记录最高的是Chloroflexus sp。Y400fl( 4个CRISPR 座位中的1个具有374个R-S重复单位)和Verminephrobact ereiseniae(249个)[2,8]cas基因多达45个家族[9]，根据CAS蛋白的序列同源性、组成情况和功能，可将CRISPR系统分为8个亚型:Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube，各亚型通常具有2－6个亚型特异的cas基因，在没有CRISPR系统的基因组中则不存在相关基因[8]。cas1－cas6这6个家族广泛存在于不同的CRISPR亚型，被认为是核心cas基因，其中只有cas1和cas2家族存在于所有的CRISPR亚型，因此，cas1和cas2家族基因也被用作鉴定CRISPR系统的分子标记[10]。 此外，间区序列(S)也具有极其丰富的多样性，Horvath等[12]在嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的124个菌株中发现了3626个间区序列，分布在3个CRISPR座位，其中，77%、16%和7%的S序列分别与噬菌体、质粒和嗜热链球菌基因组序列具有同源性。在Bacillus thuringiensis菌YBT-1520和CT-43菌株的染色体上均没有鉴定出CRISPR系统，而在YBT-1520菌株的大质粒pBMB293和CT-