组织切片免疫组化-张.docVIP

组织切片免疫组化 雄鼠肾囊膜移植ES cell 4-6周处死小鼠，1％多聚甲醛固定4℃保存（无限时）， 脱水 50％乙醇30min60％乙醇30min 70％乙醇 过夜80％乙醇 60min90％乙醇 60min95％乙醇① 20min95％乙醇② 25min100％乙醇① 20min100％乙醇② 25min透明 ⑴ 以上每次移前快速用滤纸吸，但不能干，组织块轻夹，避免损伤，或者将组织快放在离心管中，依次加入不同浓度的乙醇，每次更换时，吸出大部分的乙醇，将剩余的连组织块倒在滤纸上，再立即反过来将组织块导入离心管，再加下一个浓度的乙醇） ⑵ 液液之间误差约为1min，进入后摇晃 透明 100％乙醇＋苯（1：1）10min 苯① 过午苯② 10min浸蜡 浸蜡（62℃ 恒温箱,将组织块放在铁网中，挨个转移） 蜡①10min蜡②20min蜡③ 20min 包埋：石蜡盒底部事先用手指涂点甘油，石蜡未凝固时将组织块拟切面朝下中间放置，盖上镂空塑料托，石蜡凝固后，自来水，完全冷却后，将包埋盒与塑料托分离，组织块应该留在托一边，收藏好等待切片（避尘） 【蜡若凝固于组织块外围，将器皿搁酒精灯上烤烤，化后移入温箱】 【组织块由苯移入蜡时，瓶边靠上即可，不用滤纸，在蜡之间移动组织块要快，尽量避免凝固】 【用苯替代二甲苯透明可放置较长时间，组织块不易脆】 切片 展片，贴片 卧式染缸＋2/3蒸馏水+10滴蛋清甘油， 混匀； 将蛋清甘油水溶液摸匀载玻片上，磨砂面朝上； 将玻片在酒精灯火焰上晃3-5下（夏天）或6-8下（冬天） 用手术刀取一段适宜长度的切片，移到载玻片液滴上，光面朝下； 用展片针将皱的组织展开 用手术刀分开组织片段，移于另一载玻片（事先蛋清甘油水溶液滋润）中间； 组织方向尽量保持一致（根据形状，或有绒毛的朝上）置于片盘上，做好标记； 移入恒温箱前，不能让切片干掉，要保持适度湿润（否则切片烤后不牢），但切片周围尽量不要留有蛋清甘油，以免染色后影响片子美观； 移入48℃恒温箱，烤片，过夜，2天都行。 染色，封片 1.脱蜡 二甲苯① 3min 二甲苯② 3min100％乙醇① 5min100％乙醇② 5min95％乙醇① 5min95％乙醇② 5min90％乙醇 5min80％乙醇 5min70％乙醇5min自来水 3min蒸馏水 3min染色（或修复，抗体，显色，如果作免疫组化不能用脱过伊红的酒精去脱水）苏木精 7min（染色前将漂浮的氧化物用滤纸捞起，要慢放慢提，避免将沉淀悬浮起）自来水漂洗5min（置盆中流水冲洗，水不能直接冲在玻片上）酸酒精 浸提N次（4次）（根据分色情况定）自来水漂洗5min（回色） 漂洗前先用自来水洗一遍（漂洗后观察分色情况）蒸馏水 3min 伊红 5min 若置于90％酒精中褪色很快，往伊红中加200ml冰醋酸，搅匀，重复染色至深桃红（染色稳定后一般不再加冰醋酸）70％乙醇 浸提80％乙醇 浸提90％乙醇 3min95％乙醇① 5min95％乙醇② 5min100％乙醇① 5min100％乙醇② 5min二甲苯＋100％乙醇（1：1） 3min二甲苯①3min二甲苯②3min （浸在二甲苯中，一片封完取另一片）封片 封片 擦干二甲苯中性树胶滴于组织边盖玻片朝上一面酒精灯上晃一下（去水分）盖玻片一边小心置于树胶液滴外沿轻轻盖上（组织应在中间）置片盘晾干（片盘晾干） 【从脱蜡起直至封片，注意组织片均不能干】 【看片时，若是苏木精颜色有点发黑，说明透明时组织干了】 【看片时，若发现杂质，一要注意苏木精染色时要去氧化物，染色时要轻放轻取，二要在自来水漂洗前将水龙头包上棉花，纱布过滤】 免疫组化： 修复柠檬酸缓冲液放在烧杯中，置于水浴中，当柠檬酸缓冲液温度达到95度时，将玻片放入柠檬酸缓冲液中，当温度达到92度开始计时92-98度30min，取出凉到室温，再将玻片取出，（柠檬酸缓冲液只能使用一次），我放置了2.5hr才取出。然后蒸馏水洗，PBS洗5min，3次，最后一次时间可长， 1擦去玻片周围的水，放置在湿盒中，加B液，盖上湿盒； 2再取另一片重复上一步，大约9片后计时15min；然后全部结束； 3.时间到后，从第一片开始取出玻片用蒸馏水冲洗2-3次，放入浸在PBS的架子上，继续另一片； 4．全部结束后计时5min，3次，期间提起架子混匀液体; 5.最后一次洗涤时间到后，取出按照1和2的步骤加一抗，和空缺一抗对照；【注意放置一抗过夜时一定要放平湿盒，保证液滴不流，否则标本会干】 6．重复3和4步 7 重复5加A液 8重复6 9重复5加DAB显色液6min 10蒸馏水冲洗，终止显色，浸入蒸馏水中的架子上；苏木精复染同前苏木精染色。直至封片。 试剂的配制： 各级浓度酒精 1％伊红：1g曙红Y溶于100ml 70％