生化试验设计之蛋白质与核酸的定性定量试验解决方案.docVIP

生化实验设计 ——蛋白质与核酸的定性与定量 样液的区分 【目的要求】 区分样液成分。 【实验原理】 双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中能与Cu2+形成紫红色络合物，于540nm处有最大光吸收，这一反应称为“双缩脲反应”。含有多个肽键的蛋白质也能与Cu2+发生双缩脲反应。双缩脲法反应快速简便，适合用于蛋白质的定性鉴定。 核酸含有三种独特的化学成分：嘌呤和嘧啶碱基、D-核糖或2-脱氧-D-核糖和磷。所以测定核酸的方法可根据碱基的紫外吸收，戊糖的特殊反应或测磷。应用D-核糖或2-脱氧-D-核糖各自特殊的颜色反应，可鉴别RNA和DNA。 地衣酚和D-核糖反应呈蓝绿色，可用于定性鉴定RNA。DNA在酸性加热条件下降解释放脱氧核糖，2-脱氧-D-核糖与二苯胺反应呈蓝绿色，可用于定性鉴定DNA。地衣酚反应的特异性较差，凡戊糖（包括DNA）均有此反应，而核糖对二苯胺反应没有影响。故只进行二苯胺实验便可区分DNA与RNA。 【实验条件】 试剂 蛋白质与核酸样液 双缩脲试剂：取1.50g五水硫酸铜（CuSO4.5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6.4H2O）于500ml蒸馏水中溶解，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水配成1L。 3.二苯胺试剂：称取1.0g重结晶的二苯胺溶于100ml分析纯的冰醋酸中，再加入10ml过氯酸（A.R,60%以上）或2.75ml浓硫酸混匀待用。（有的临用前加入1.0ml 1.6%乙醇溶液以提高反应灵敏度） 器材 玻璃棒1支，滴管2支。 白瓷板1块。 试管2支，试管夹2个。 10ml量筒1个。 电炉。 500ml烧杯1个。 【实验方法】 蛋白质的鉴定 用玻棒分别蘸取双缩脲试剂滴加于白瓷板左右两边上，用滴管从两瓶样液中各取一滴分别滴加到双缩脲试剂上，若溶液颜色由蓝色变为紫红色则滴加的为蛋白质样品，而另一份样品为核酸。 核酸的鉴定 取两支干净试管，一管加入1.5ml核酸样液，另一管加入蒸馏水1.5ml，向两管各加入3.0ml二苯胺试剂，于沸水中加热10min,若样液由乳白色变成蓝色则该样品为DNA溶液，若未变蓝色则该样品为RNA溶液。 【注意事项】 蛋白质的纯化（疑问：可能含有的杂质有哪些？是分离杂蛋白还是分离非蛋白杂质？需要纯化到哪一步？分子量范围？） 【目的要求】 纯化蛋白质样品溶液。（测定含量及等电点用到蛋白质盐析分级分离及凝胶层析脱盐就可以了） 【实验原理】 沉淀法是蛋白质分离纯化初期常用的手段之一。它除了可以尽快将蛋白质与杂质分开外，还可以迅速减少样品体积，起到浓缩的作用，以便后续的纯化。沉淀法包括盐析法、等电点沉淀法，有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。本实验使用盐析法沉淀蛋白质。 用大量中性盐可使蛋白质从溶液中析出。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下可脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，可使蛋白质胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等。应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大，分离效果好而不易引起蛋白质的变性。在盐析过程中相对分子量大的蛋白质比相对分子量小的易于析出。改变盐浓度，能使得不同相对分子质量的蛋白质分别析出。 盐析后得到的粗品溶液需要进一步纯化以浓缩脱盐。常用的方法有吸附法、超滤法、透析法等。之后可运用离子交换色谱、疏水作用色谱和亲和色谱等高分辨率的操作单元进行进一步纯化。目前使用较多的是交联葡聚糖凝胶（Sephadex）层析法。它根据物质的分子大小进行分离。含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，相对分子质量小的盐分子因进入凝胶颗粒的微孔中而减慢向下移动的速度，而分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶颗粒微孔中，得以较快的速度通过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。 【实验条件】 试剂 1. 器材 蛋白质含量的测定 【目的要求】 用考马斯亮蓝染色法对蛋白质样品进行含量测定。 【实验原理】 蛋白质含量的测定方法有微量凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚法、考马斯亮蓝染色法、BCA法、紫外（UV）吸收法等。其中考马斯亮蓝染色法简便迅速，重复性好，精确度高，抗干扰性较好，故本次实验使用该法进行蛋白质含量的测定。 考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。结合蛋白质后，它从游离态的红色转变为蓝色，最大光吸收波长由465nm变成595nm。在一定的蛋白质浓度范围内（0~1000μg/ml），蛋白质和染料的结合符合比尔定律（Beer’s law），故可以通过测定595nm处光吸收的增加量知其与蛋白质结合的量。 【实验条件】 试剂 未知蛋白质样液 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用去离子水稀释至1000ml，滤纸过滤。 标准蛋白质溶液：