实验六 植物组织基因组DNA的提取与分析(CTAB法).pptVIP

六、注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步（研磨）的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 * 实验六 植物组织中DNA的提取与分析 温馨提示：1、请将教室水浴锅打开，温度调至65℃。2、实验中-20℃冰浴时，请将样品放入6309室冰箱冷冻层。 * （1）掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 （2）掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法 一、实验目的 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 二、实验原理 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 之后可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到较纯的DNA制剂。 CTAB法流程图： 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 异丙醇沉淀 DNA溶液 * 三、仪器和试剂 1、仪器： 恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。 2、试剂： 液氮、CTAB提取缓冲液、氯仿:异戊醇（24:1）、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液（0.5%溴酚蓝+40%蔗糖）、1×TAE电泳缓冲液。 四、实验步骤 称取0.1g植物幼苗 加入适量液氮充分研磨，全部转入1.5ml离心管中 加入0.5ml CTAB提取缓冲液，充分混合均匀 65℃水浴10min，其间缓慢颠倒3次 加入0.5ml氯仿:异戊醇，上下颠倒充分混匀 12000r/min离心10min 将上层水相移入另一新离心管 加0.5ml预冷异丙醇，-20℃冰浴30min 12000r/min离心10min 弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮 弃上清，加20μLTE溶解沉淀，即得DNA溶液 12000r/min离心10min 1、DNA的提取 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。 * 四、实验步骤 2、DNA电泳检测 （3）上样电泳：将20μLDNA样品溶液和5μL上样缓冲液混匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。 （4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。 * 五、实验结果与分析 1 2 3 4 图1 植物组织基因组DNA提取结果 将凝胶图片打印出来，需要说明： 1、小组点样孔号； 2、DNA质量分析。