WB--流程2014-12.19要点.docVIP

WB实验基本流程 -----------406 ⒈制胶试剂准备和检查，尤其是pH的校正 ①超纯灭菌水 ②30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺 29 g N,N′-亚甲双丙烯酰胺 1 g 80-90 mL Total 100 mL Note: 37℃（温热）水浴溶解；严格核实pH不得超过7.0（因为可以发生由光催化或碱催化的脱氨基反应）；棕色瓶避光RT或4℃保存，有效期﹤2个月；如有沉淀，可以过滤； Tris-Cl；pH8.8；1.5 M/LTris-base 90.86 g 18.15 g 超纯灭菌水 400-450 mL 80-90 mL Total 500 mL 100 mL Note: 用浓盐酸调节pH到8.8；总体积100 mL时浓盐酸需要约3 mL或48 m1 mol／L HCl；4℃保存；可以过滤；只能用Tris碱制备，再用HCl调节pH，而不能用Tris-Cl和Trizma制备（盐浓度过高，多肽会在凝胶中不规则迁移，导致蛋白质电泳条带极度扩散）; 灭菌后；RT或4℃； Tris-Cl；pH6.8；1 M/L（浓缩胶用） Tris-base 30.29 g 超纯灭菌水 150-200 mL 200 mL Note: 用浓盐酸调节pH到6.8；也有的人用0.5 M/L的，我也用过，实验时小分子蛋白跑不开来，主要表现为30 KD以下就没泳道啦！（不知是这原因否，还是缓冲液被污染啦）总体积100 mL时浓盐酸需要约7-8 mL；只能用Tris碱制备，再用HCl调节pH，而不能用Tris-Cl灭菌后； RT或4℃； 10%SDS（二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠） SDS 10 g 超纯灭菌水 80-90 mL 100 mL Note: 50℃水浴溶解；也有的说68℃溶解；RT保存；如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。不同厂家的SDS对多肽迁移的图谱变化甚大，还是专门使用同一品牌的SDS为好。 10%过硫酸铵（APS） APS 0.1 g 超纯灭菌水 1 mL 1 mL Note: 溶解混匀后4℃避光保存，基本上3天过期；可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5 ml EP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水即可。APS能提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基。 TEMED（N, N, N′,N′,-四甲基乙二胺）Note:从大瓶中用EP管取一小管，4℃贮藏，别放-20℃（有一次错放啦效果发现变差了，不过具体原因不明）；TEMED能催化APS形成自由基；应用电泳级TEMED；TEMED只有在游离碱状态下起作用，故低pH下聚合反应受到抑制。 0.1%SDS（用于隔绝氧气）Note:将10%SDS稀释100倍，取0.1 mL 10%SDS，水10 mL混匀即可；RT存放。 （1.0 mm还是1.5 mm） 成分 配置不同溶度不同体积凝胶所需量/mL 10%-10mL 12%-10mL 15%-10mL 10%-20mL 12%-20mL 水 4 3.3 2.3 7.9 6.6 30%丙烯酰胺混合液 3.3 4.0 5.0 6.7 8.0 1.5mol/LTris(pH8.8) 2.5 2.5 2.5 5.0 5.0 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 10%APS 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2