高级_生化课件生物化学技术原理与应用.ppt

生物化学技术原理及应用 第一编 概 述 第二编 纯化方法 第三编 鉴定方法 第一编 概 述 第一章 生命大分子物质的制备 第一章 生命大分子物质的制备 第一节 材料的选择与处理 第二节 确定测定方法 第三节 细胞的破碎 第四节 抽提 第五节 浓缩 第六节 纯化方案的设计与评价 第七节 有效成分纯度和性质的分析 第八节 应用实例 第一节 材料的选择与处理 一、材料的选择 二、材料的处理 一、材料的选择 有效成分：指欲纯化的某种单一的生命 大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。 材料选择原则(1)含量多、稳定性好； (2)来源丰富、保持新鲜； (3)工艺简单、有利用价值。 二、材料的处理 1、动物脏器： (1)冰冻：短时间零下10℃冰库或零下70 ℃低温冰箱（数月）贮存； (2)脱脂：人工剥离；有机溶剂；快冷快热；脂肪分离器； (3)干燥：丙酮中脱水；沸水中蒸煮烘干。 2、植物组织： (1)叶片：水洗净或在10小时内置零下4 ℃到零下30 ℃冰箱贮藏备用; (2)种子：泡胀或粉碎。 3、微生物： (1)胞内活性分子：离心法收集上清液，低温 下短时间贮存; (2)胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取， 制成冻干粉。 第二节 确定测定方法 一、目的和要求 二、常用的测定方法 一、目的和要求 确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性 二、常用的测定方法 1.光谱法 (1)吸收光谱法（absorption spectrophotometry) ①直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液 移至分光光度计，读取吸光度。吸光度与待测物 浓度成正比。例如：总蛋白含量的测定。 ②比色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的 底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如： 酶活性的测定。 (2)荧光光谱法(fluo-spectrophotometry) 激发光激发待测物质发射发射光，读取 荧光强度。荧光强度与待测物质浓度成正 比。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏 度比吸收光谱法好。例如：乙醇中蒽的测定。 (3)浊度法 极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在 不被吸收的波长下表现的消光值。 2.电化学法 有些反应可放出质子氢，可用PH计或 NaOH滴定等方法追踪变化计算出待测物的 含量。 3.生物活性检测法 细胞或动物摄入待测物质后，待测物质 摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相 关性，以此检测待测物质含量。 4.免疫分析法 利用抗原与抗体的特异性反应，并结合 生物标记，可对待测物质进行定量定性分 析。 5.生物传感器 用生物传感器中的敏感膜与待测物质反 应，可通过显示器反映有效成分的含量。 第三节 细胞的破碎 1.物理方法 2.化学处理 3.生物方法 1.物理方法 （1）研磨法：研钵，匀浆器 （2）捣碎法：捣碎器 （3）超声波法：超声仪 （4）压榨法:挤压 （5）冻融法：低温冷冻迅速取出 2.化学处理 （1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯 （2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十 二烷基硫酸钠 3.生物方法  （1）溶胀 （2）自溶 （3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K 第四节 抽提 一.抽提的含义 二.抽提有效成分的影响因子 一、抽提的含义  用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。 二.抽提有效成分的影响因子 1.PH值 2.溶剂的极性和离子强度 3.水解酶 4.温度：选择合适的抽提温度 5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度 6.氧化 7.金属离子 8.抽提液与抽提物的比例:1:5 1.PH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电 解质物质，选择抽提液的PH值在偏离等电 点。 2.溶剂的极性和离子强度 有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液中稳定，有些则相反 加入蔗糖、甘油、DMSO降低溶液极性 加入KCL、NaCL、NH4CL升高溶液离子强度 3.水解酶 为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生 反应，采取以下措施： (1)加入PMSF等酶抑制剂； (2)调节抽提液的极性、离子强度和PH值。 6.氧化 一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液 中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入2-巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。 植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在