O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法.docVIP

O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法 摘要：本发明提供了一种-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs）的制备方法(或不影响药物活性)条件下制备纳米药物载体急需研究的课题。壳聚糖是一种亲水性物质，它仅能包裹一些亲水性大分子，而对于疏水性药物，壳聚糖要作为载体还存在难度。 疏水性强的纳米粒易与肠上皮细胞进行生物粘附，而离子化和具有强亲水链表面的纳米粒不易被胃肠道粘膜粘附。疏水性强的纳米粒易于被摄取，因为疏水性纳米粒易于被生物粘附并且对M细胞有更强亲和力。 为解决上述问题，本论发明过对壳聚糖进行一定改性，得到带有正电荷的壳聚糖季铵盐：O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan，-2-HACC）NDV）通过离子交联的方法进行更好的结合，得到一种新型的载药微球O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs）。这种方法简便易操作，制备过程中所需溶剂均为常用试剂，容易获得，成本低，后续处理也较为简单。该载药微球带正电荷因此具有黏膜渗透性和生物黏附性，可以使抗原穿过黏膜屏障与黏膜下的淋巴细胞产生作用，也可以延长其抗原与黏膜的作用时间，延缓抗原被清除。  权利要求书 一种O-2-新城疫减毒活疫苗纳米粒，其特征在于包括以下步骤： 1、-2-HACC的合成 壳聚糖ETA与壳聚糖的氨基开环反应合成-2-HACC。 2、NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs制备 采用法制备NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs。 、根据权利要求1所述的O-2-HACC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为： N-(b)的合成 取壳聚糖粉末a3.0g溶于120ml的10%醋酸溶液中，缓慢加入乙醇60ml后，室温下搅拌30min内逐渐滴加苯甲醛15.8g(149mmol)，继续搅拌1h后，所得产物于烘箱(35℃~50℃)中放置20h。 缓慢滴加稀1.2mol/L的NaOH溶液将溶液调至中性，真空抽滤析出的沉淀，并用甲醇多次洗涤所得固体除去未反应的苯甲醛，得纤维状浅黄色固体b。 O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖(c)的合成 b2.75g置于圆底烧瓶中，加入异丙醇50ml和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵9.0g，水浴70℃搅拌反应16h，过滤，依次用甲醇、丙酮洗涤沉淀，得乳白色固状物c。 O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(d)的合成 50ml 0.25mol/L的HCl乙醇溶液中加入c3.0g，室温搅拌24h后蒸去大部分乙醇，得胶状物，加入15ml H2O充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，固体于烘箱(80℃)中烘干，得浅灰色固状物d。下图为d的结构式。 样品精制 取d 1.0g溶于20ml蒸馏水中，用足量的丙酮进行沉淀，抽滤，得到的沉淀以少量蒸馏水溶解，置于透析袋中透析48h，并时常更换蒸馏水。待浓缩到一定体积时，加入足量的丙酮重新沉淀，抽滤，固体真空干燥，所得样品供IR和NMR分析用，类似方法精制c。 4、根据制备权利要求所述的NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为： 1）取O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1.2mg/ml的溶液，然后取5ml并滴加6ml新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A； （2）溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s，然后滴加3.5ml浓度为1.5mg/ml的三聚磷酸钠（TPP），维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌15min，再滴加1ml的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，然后滴加1ml的司班-80，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，获得溶液B； （3）将溶液B于4℃、12000r/min离心20min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入浓度为0.01mol/L的PBS 悬浮，获得载新城疫病毒O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒； （4）在NDV/La Sota-O-2-HACC-NPs悬液中体积比1∶1加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶（含1%的海藻糖），真空冷冻干燥24h，获得新城疫O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒La Sota系活疫苗，简称为NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs/LV。 5、根据权利要求1或所述的方法，其特征在于权利要求的步骤（1）所述的根据权利要求1或所述的方法，其特征在于权利要求的步骤（1）所述的%。 7、根据权利要求1或所述的方法，其特征在于权利要求的步骤（1）所述的N-苯亚甲基壳聚糖于烘箱(35℃~50℃)中放置20h。