1989Chemiluminescenceenzymeimmunoassay讲解.docVIP

分析科学，十月1989卷，5 化学发光酶免疫分析法 Akio Tsuji, Masako MAEDA and Hidetoshi ARAKAWA 药学院，昭和大学，日本东京品川 我们的实验室的研发高度敏感的化学发光酶免疫分析法。氧化酶，过氧化物酶和葡萄糖氧化酶产生的H2O2，可通过异鲁米诺/微过氧化物酶和过氧草酸酯/荧光染料测定。使用乳糖/葡萄糖氧化酶的酶偶联反应法基础上，β-D-半乳糖苷酶也能通过化学发光反应测定。通过使用邻硝基苯-β-D-半乳糖苷酶作为底物和NADH化学发光反应在半乳糖脱氢酶酶偶联反应之后，β-D-半乳糖苷酶能被测定。蔗糖和光泽精通常作为底物，使用化学发光试剂测定蔗糖酶。6-磷酸葡萄糖是通过以葡萄糖-6-磷酸为底物的化学发光测定NADH来检测的。碱性磷酸酶是通过使用NADP+，乙醇脱氢酶和NADH化学发光反应来检测的。这些方法可以成功地应用于化学发光酶免疫测定生物液体中的各种激素和药物。 关键词：化学发光酶免疫分析法，化学发光，酶，鲁米诺，异鲁米诺，光泽精，双（2,4,6-三氯苯基）草酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，17α-羟孕酮，甲状腺素，群集筛查，先天性甲状腺功能减退症，先天性肾上腺皮质增生症 1 引言 自从30年以前雅洛和博森的引进，放射免疫法(RIA)使得浓度极低许多激素和药物的测量成为可能，从而开辟了一个新的高灵敏度检测途径。尽管它成功了，但涉及使用的同位素标记的抗原或抗体可能造成相关的废物处理，半衰期短和标记辐射问题。为了避免这些缺点，同时保留特异性的酶免疫分析法，各种改进RIA被开发，如酶免疫分析法（EIA），荧光免疫分析法，粒子免疫分析法，自旋免疫分析法，化学发光免疫分析法，生物发光免疫分析法。 在这些方法中，酶免疫分析法方法是最有用的技术，因为它和放射免疫法一样具有很高的灵敏度。实验室设备要求相对便宜，容易获得，和反应试剂的价格合理，并有很长的保存期限。 近年来，化学发光和生物发光（CL，BL）分析法对药物和临床诊断的生化分析有着一定的影响，CL是观察到的一种现象，这种现象是当一个激发态的产品转变到基态时产生的化学能以光的形式发射。大量的分子是能够表现出CL，但只有少数几个能强烈表现出CL，最有名的化学发光反应是鲁米诺，光泽精和活泼的草酸盐。为了增加免疫分析的灵敏度许多研究者探索了CL或BL的使用。这些CL和BL免疫测定法已被分为四种类型，如下：（1）免疫分析法使用CL标签（如—异鲁米诺衍生物或吖啶酯），（2）酶免疫分析法（EIA）依靠CL反应监测（例如，鲁米诺/过氧化物酶/过氧化氢），（3）酶免疫分析法（EIA）依靠BL反应监测（例如，荧光素酶和荧光素），和（4）免疫分析法依靠BL反应使用的辅因子作为标签和监控的手段。 在这篇综述中，化学发光免疫分析法在我们的实验室研究发展已经描述过。 2化学发光反应 2.1、鲁米诺和异鲁米诺 鲁米诺一直是研究最多的CL分子（图1），尽管它有非常广泛的研究但是其在水溶液中详细的反应机理仍然是不清楚。鲁米诺在碱性过氧化氢和催化剂的存在下发光。各种氧化剂都能引发反应，许多化合物都能催化或影响鲁米诺反应。这些化合物的范围可以是从简单的过渡金属离子到大分子，如过氧化物酶。在水溶液中鲁米诺反应是非常依赖pH值，只有在接近中性的PH值范围7到8过氧化物酶催化鲁米诺/过氧化氢体系才能有效的产生光。 各种异鲁米诺衍生物的合成—因为鲁米诺发光强度随着烷基化和酰基化减弱，特别是5-氨基鲁米诺替代物的乙酰化。鲁米诺的6-氨基异构体，异鲁米诺，实际上提高了效率烷基化与衍生工具的使用。氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEI）和氨基己基乙基异鲁米诺（AHEI）已应用于化学发光免疫分析法。 我们已经开发了CL酶免疫分析法，以辣根过氧化物酶（HRP）作为标签测定皮质醇和脱氢表雄酮。” 2.2双（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）/荧光染料 Rauhut报道的过氧草酸酯型化学发光反应是已知的最有效的非酶化学发光反应，具有量子产率高达25%。这个利用TCPO /过氧化氢/荧光染料的反应机理如图2所示。过氧化氢和草酸酯（TCPO）反应，生成中间体可多达105千卡/摩尔的能量转移到荧光受体。1,2-二氧乙基二酮是这个反应中假设的关键中间体。荧光受体成为激活态，然后发出它的特性的光。 舍曼等指出二萘嵌苯在各种荧光芳香族化合物中显示出最强的化学发光反应。我们重新审视各种水溶性荧光染料，因为它应该可以适应在TCPO化学发光方法的酶免疫分析法系统。通过利用8-苯胺基萘-1-磺酸盐（ANS）已经获得S/N比例的最高值。荧光素在这反应同样表现出良好的反应。利用TCPO /ANS化学发光分析法测定过氧化氢已经被说明，如图3所示