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环境工程微生物学
实验方案
实验题目:
污泥中细菌总数测定和抗Cu细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察
组长:XXX
组员:
XXX XXX
XXX XXX
实验目的
学习污泥样品的采取方法和污泥样品细菌总数测定的方法。
了解平板菌落计数法的原则。
熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
了解配制微生物培养基的基本原理,掌握常规的配制、分装培养基的方法。
学会各类物品的包装、配制和灭菌技术。
从污泥中分离、培养微生物,掌握常用的分离微生物的方法。
学会接种技术。
观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。
二、实验原理
1、测细菌总数原理:微生物活体数量的测定方法,常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液,再取一定的稀释液接种,使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内,最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克(或m)样品中的活菌数量。
微生物的接种
恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基;
灭菌的玻璃塞瓶1个,三角烧瓶/烧杯4个,灭菌培养皿9个,1ml移液管6支、10ml 2支、试管3支,PH试纸、玻璃棒、记号笔1支,100ml量筒,滴管2支。
2、分离纯化
(1)样品:污泥
(2)仪器:高压蒸汽灭菌器、干燥箱、酒精灯或煤气灯、稀释水、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、滴管、吸水纸、镊子、搪瓷杯、高温灭菌锅、移液枪(枪头)、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、滤纸、pH试纸和棉花、接种环、酒精灯、恒温培养箱、4大类菌落(培养皿)
(3)试剂或材料:牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂、Cu离子试剂等
四、操作步骤
1. 玻璃器皿的准备
(1)洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡,再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。
(2)包装
A.移液管的包装:移液管的吸端用细铁丝(或牙签)将少许棉花塞入构成1-1.5cm长的棉塞,起过滤作用(以防细菌吸入口中,并避免将口中细菌吹入管内)。棉塞要塞的松紧适宜,吸时既能通气,又不致使棉花滑入管内。然后将塞好棉花的移液管的尖端,放在4-5cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30度夹角,折叠包装纸包住移液管的尖端,用左手将移液管压紧,在桌面上向前搓转,纸条螺旋式地包在移液管外面,余下的纸折叠打结,待灭菌。
B.培养皿的包装:培养皿由一底一盖组成一套,用牛皮纸或报纸将8套培养皿(皿底朝里,皿盖朝外,4套、4套相对而放)包好。
2. 培养基的配制
(1)配制溶液
取一定容量的烧杯盛入100mL蒸馏水(有时也可用自来水),按培养基配方(0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g琼脂、重金属Cu离子)逐一称取各种成分,依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解,待全部溶解后,加水补足因加热蒸发的水量。在制备固体培养基加热融化琼脂时要注意搅拌,避免琼脂糊底烧焦。
(2)调节pH,再加琼脂
一般刚配好的培养基是偏酸性的,故要用质量浓度为100g∕L NaOH调pH至7.2-7.4.应缓慢加入NaOH,边加边搅拌,并不时用pH试纸测试。调整至所需的pH。
(3)分装
A.分装试管:将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管,右手控制弹簧夹,将培养基依次加入各试管,用于制造斜面培养基时,一般装量不超过试管高度(15mm*150mm))
5.污泥样品的采取
取距污泥面10-15cm深层污泥样品,先将灭菌的带玻璃塞瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱中保存。
6.细菌总数测定
(1)取加入9ml水的灭菌试管。取1ml污泥样品注入第一管9ml灭菌水内,摇匀,再自第一管取1ml至下一管灭菌水内,如此稀释到第三管,稀释度分别为10-1、10-2与10-3。一般中等污秽污泥样品,取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度,污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
(2)自最后一个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中,每一稀释度做两个培养皿。
(3)各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的培养基,立即放在桌上混匀。
(4)凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。
细菌的纯种分离及培养(平板表面涂布法)
(1)取样:用无菌瓶从人工污泥中取一定量的污泥,迅速带回实验室。
(2)融化培养基:加热融化培养基,待用。
(3)稀释样品:将1瓶90ml和5管(根据预备实验数据变化)9mL的无菌水排列好,按10-1、10-2、10
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