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故事发生在1983年的春夏之交 Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 ℃一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。 DNA， 生命的蓝图 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR反应体系 1、 10×PCR buffer 10μl 2、dNTP mix 各200μmol/L 3、引物1 1μmol/L 4、引物2 1μmol/L 5、DNA模板 50ng-1μg 6、Taq 酶 2U 7、加双蒸水至总体积为100μl （三）引物的延伸（新链DNA的合成） 70℃~75 ℃，30~60s （2kb) 首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不一。 第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点。 N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。 引物本身也是新生DNA链的一部分。 Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * A C G -T Polymerase Chain Reaction - PCR Specific short DNA primer anneals to strand to be copied 5’ 3’ A T C G T A PCR反应 第六节、PCR扩增的基本方法 一、 仪器 台式微量离心机 基因扩增仪 微量塑料离心管：0.5ml或1.5ml（经高压灭菌） 微量加样器：20P、200P、1000P， 电泳仪及电泳槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手套、Tip若干 PCR Agarose gel electrophoresis The final product UV visualisation 3-4 hours 二、 PCR反应试剂 1.模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 2.引物 0.2-1 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 3.Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 4.dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，50-200 ?mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 5. Mg2+ Mg2+是DNA聚