现代光-6标记方法教案分析.ppt

第四章 荧光法在生物分析中的应用 混合酸酐法： 偶联物一方的羧基与氯甲酸异丁酯反应，形成混合酸酐。这是一种非常活泼的中间体，它能与氨基化合物反应形成酰胺键。 戊二醛法 ：戊二醛是一个双功能试剂，它的二个醛基能分别与标记化合物及被标记物的氨基形成Schiff键。 过碘酸法； 此法的必要条件是偶联物一方含糖，另一方含氨基。糖的羟基被氧化成醛基，然后与氨基作用形成Schiff键。 N—羟基琥珀亚胺活化法 ：不少抗原含有 羧基，可通过N—羟基琥珀酰亚胺活化，在与氨基化合物偶联。 琥珀酸酐法： 偶联物一方的羟基与琥珀酸酐反应，得到一个琥珀酸半酯，通过这个带羧基的中间体，与氨基形成酰胺键。 O—（羧甲基）羟胺法： 抗原的酮基（或引进的酮基）与O—（羧甲基）羟胺反应，产生O—羧甲肟衍生物，这个中间产物的羧基与另一化合物的氨基结合。 重氮化法 ；芳香胺的重氮盐能以蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基的邻位反应，形成偶氮化合物。 量子点的发光原理 量子点的生物安全性 美国加州大学分校的Derfus等发现，CdSe量子点在某些情况下有一定的毒性，当经过合适的修饰后，CdSe量子点可变得无毒并且可在体外进行细胞移植和重组。 任吉存研究小组以谷胱甘肽为稳定剂合成了水溶性和生物相容性的CdTe QDs。比起别的硫醇修饰的量子点，谷胱甘肽修饰的CdTe QDs具有更加优良的生物亲和性。且谷胱甘肽对Cd2+具有解毒作用，因此也降低了CdTe QDs的生物毒性。 制备核壳结构的量子点。 量子点的制备方法 2. Thiol-Reactive Probes In proteins, thiol groups (also called mercaptans or sulfhydryls) are present in cysteine residues. Thiols can also be generated by selectively reducing cystine disulfides with reagents such as dithiothreitol.  Structural comparison of the reducing agents DTT and TCEP. Unlike DTT (dithiothreitol, D1532), TCEP (tris-(2-carboxyethyl)phosphine, hydrochloride; T2556) does not contain a free thiol, and therefore may not require removal before reaction with a thiol-reactive probe. ????????Reaction of a thiol with an alkyl halide. Reaction of a thiol with a maleimide(顺丁烯二酰亚胺). 标记纳米粒子 三、核酸的荧光分析 标记寡核苷酸 分子灯标（Molecular Beacon） 1996 年,Sanjay Tyagi 等设计了一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针,这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后发生构象的变化而发出荧光,他们将其命名为分子信标(Molecular Beacon) 。分子信标因其具有背景信号低,灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点,在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、DNA、RNA 的检测、DNA/ RNA 杂交的动力学研究以及DNA/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。 分子灯标 （Molecular Beacon） 是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子。 它包括一个环(loop)干(茎stem) 结构,其中环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成, 一般有15～20 个碱基;干为两列互补的碱基序列,一般是5～7 个碱基对。分子信标之所以能通过构象改变而发荧光是基于它内在的环茎结构和荧光标记特征:在分子信标中,荧光基团共价地连接在其干部分的一个末端,猝灭基团也靠共价键连接在干部分的另一末端。分子信标未与靶分子结合时,由于干部分两列互补碱基对之间的氢键连接,使得荧光基团与猝灭基团距离很近,荧光基团将能量转移给猝灭基团而发生荧光猝灭;当分子信标与序列互补的靶分子结合时,环与靶序列杂交而形成了比干部分更长更稳定的碱基对氢键连接,分子信标发生构型的变化,干部分被打开,从而使荧光基团远离猝灭基团,荧光基团产生的荧光得到恢复。 分子信标这一荧光信号传导机制