第2章细胞培养技术与应用-1详解.ppt

第二章细胞培养技术与应用 第一节 细胞培养与细胞工程概述 第二节 培养细胞的细胞生物学知识 第三节 细胞培养的基本条件 第四节 鱼类动物细胞培养技术 第五节 细胞培养技术的应用 鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备 鱼类细胞毒理学：评价样品对鱼类细胞的毒性等 水产生物基础理论 鱼类免疫学 动物细胞与植物细胞的比较 细胞分裂的意义？ 单细胞生物 细胞分裂、生长、分化的结果 分裂：使细胞数目增多 生长：使细胞体积增大 分化：使细胞种类增多 （2）化学致癌因子： 及时确认发生的微生物污染 最常发生的是霉菌和细菌污染。 霉菌污染易于发现，如培养液中长出了各种菌落，肉眼可见，不难确认细菌感染时，有的引起培养液混浊，镜下可见大量细菌，有的培养液无明显改变如怀疑污染，必要时可向肉汤或琼脂培养基里滴少量培养物，置37℃温箱培养数日，观察有无菌落形成，以验证是否污染。 经常发生和难以发现的是支原体污染。PPLO体积小，只有0.25 ~1 ?m大小，且无细胞壁。 PPLO污染后的细胞仍然能生存，甚至无明显变化，有时导致培养细胞发生不同程度的病理改变。 ① 温度 2）pH值： 动物细胞生长大多需要轻微碱性环境，最佳为7.2~7.４ 3）气体 4）渗透压 去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性 如:培养的成纤维细胞 在适当刺激下，可分化为 其它结缔组织细胞和肌组织细胞，表现出类似未分化的间充质细胞的特性，‘返祖’ 。 2. 再分化：可重新表现出分化特点 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞 、内皮细胞，但，这种能力会随着培养时间延长 逐渐丧失。总之，体外培养,使细胞结构与功能上的“可塑性”增大 　　　 （1）组织块固定法 　　　当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养。 （2）机械分散法 　　　此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪成约一立方毫米耐的小块, 放入底部有一铜网的注射器内, 用手的压力将组织挤出网孔, 最后将分散的组织吹打后加人营养液分装培养。 （3）络合剂分散法 　　　目前使用的络合剂主要是乙二胺四乙酸, 它能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散, 经吹打即可分散。该法目前主要用于囊胚细胞培养及上皮型细胞系的传代。 （4）酶消化法 　　　该法是目前采用极为广泛的方法, 适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶, 常用浓度是0.25%。根据酶消化时温度的不同, 又可进一步分为冷消化法及热消化法。 （5）冷消化法 　　　此法是将组织剪成约刀的小块, 然后置一倍体积的胰酶中, 四摄氏度培养。 选取原则：个体健壮、无病，无外伤，避免选用某些携带内源性病菌的鱼类。个体越年轻，其细胞一般保持较强的分裂能力，体外培养成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼体应该是细胞传代的很好材料。 组织材料的来源 水生无脊椎动物：主要包括甲壳类、贝类、海绵等。 水生脊椎动物，主要是鱼类。 供培养的组织材料要经过严格的擦洗、消毒与多次冲洗。海洋动物的组织还需用75%酒精、稀高锰酸钾溶液或二氯化汞、双氯苯双胍己烷溶液等再处理，以杀灭海洋中一些弧菌类有机体。再用维持液反复冲掉多余消毒剂，这样处理既能杀死细菌又能维持细胞活性。 组织材料的清洗消毒 弧菌是菌体短小，弯曲成弧形，尾部带一鞭毛的革兰氏阴性菌。如霍乱弧菌。弧菌属广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。目前弧菌有91种。主要鱼贝类致菌为：溶藻弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌等 细胞悬液的分离： 组织材料的分离 组织块的分离： 机械分散法（多级筛网） 剪切分离法 酶消化法 离心法 血液、羊水、胸腔水、腹水 胰蛋白酶 胶原蛋白水解酶 2、培养方法 常用，操作简便；成功率较高 适合组织量少； 生长较慢、耗时长 注意事项：轻拿轻放，及时更换培养液 将组织剪切成小块后，接种于培养瓶中培养。 ①组织块培养法 ②消化培养法 步骤繁琐、易污染、成本高； 适用大量组织、耗时短、效率高； 应用消化分散法将组织细胞间质（基质、纤维）除去，使细胞分散，然后接种培养。 酶消化 酶消化法 采用较为广泛的方法，适用于绝大多数组织，并且在贴壁细胞传代时也多用此种方法。经常采用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶等。利用消化法得到的细胞量大，均一性好，细胞贴壁后可迅速形成单层。要注意不同组织需不同的消化酶浓度以及消化时间，否则会因消化过度而对细胞产生损伤。 胰酶-EDTA消化液 能与细胞间钙离子、镁离子结合而使细胞连接松散 冷消化 热消化 a