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* * 分为长产物片段和短产物片段两部分。 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，是需要扩增的特定片段。 不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。 * a) 在前期，扩增并不是指数增长，有一些滞后 b) 指数期，目标产物呈指数扩增 C) 平台期的到来 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐累积，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应”，这种效应称平台期（plateau）。 * 与多重PCR，稀释相关！ 问题：怎样再次PCR？ * 1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链, 然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性 配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的 DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双 链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于 富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 2. 退火：这是PCR 的一个关键参数。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同 目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70 ℃。退火温度一般设定比引物的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时, 以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形 成。如果两个引物Tm 不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃。或者为了提高特异性， 可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度 进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60 ℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反 应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 * 3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上, 引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应 时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合 成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可 适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反 应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要 4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30 轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮 循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA 样品稀释103-105 倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经 60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。 * dNTP, 脱氧核糖核苷酸 Mg2+, 要求分子数比dNTP和Tag酶多 * 0.9975 * Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。 * 在100μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq 酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。 酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。 在70℃下反应2h后，其酶活约为原来的90% 在93℃下反应2h后，其酶活约为原来的60% 在95℃下反应2h后，其酶活约为原来的40% Tag DNA聚合酶具有延伸酶活性，倾向于将一个A加到3’端，但也可以添加别的碱基，只是效率低。 Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3‘到5’外切核酸酶（校正）活性。 使用带有3‘到5’外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量 比Taq DNA聚合酶低。 * 可以混合使用两种酶 * 每条引物的浓度0.1～1umol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会 引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结